Цитологического анализа сперматогенеза: Живые и Исправлены Препараты<em> Дрозофилы</em> Семенники

Summary

Способы выделения и подготовки дрозофилы яичек образцов (жить и фиксированной) для работы с изображениями на фазе контраста и флуоресцентной микроскопии описаны здесь.

Abstract

Дрозофилы является мощным модель системы, которая широко используется для выяснения различных биологических процессов. Например, исследования обоих женского и мужских половых линий дрозофилы внесли большой вклад в современное понимание мейоза, а также биологии стволовых клеток. Отлично протоколы доступны в литературе для выделения и визуализации Drosophila яичников и яичек ^3-12. При этом методы вскрытия и подготовки дрозофилы яичек для микроскопического анализа описаны с сопровождающим видео демонстрации. Протокол для выделения семенников из брюшной полости взрослых мужчин и подготовки слайды живой ткани для анализа с помощью фазово-контрастной микроскопии, а в качестве протокола для фиксации и иммунного окрашивания яички для анализа с помощью флуоресцентной микроскопии представлены. Эти методы могут быть применены в характеристике Drosophila мутантов, которые обладают Dвидеоэффекты в сперматогенеза, а также в визуализации внутриклеточных локализаций белков.

Introduction

Drosophila яички являются идеальным модельной системой для изучения многих биологических процессов, включая регуляцию стволовых клеток, мейоза и развития сперматозоидов ^13-18. В сперматоциты и их мейотические шпиндели большие и, следовательно, удобным для цитологического анализа и расслабленной контрольно-пропускные пункты клеточного цикла во время сперматогенеза облегчить изучение мутаций в генов клеточного цикла. Различные типы клеток можно наблюдать в упорядоченной прогрессии по длине яичек, и любое нарушение сперматогенеза может привести к изменениям в этой общей договоренности. Эти характеристики в сочетании с Drosophila генетических инструментов способствовали мутационный анализ сперматогенеза ^21-23.

Этапы Drosophila сперматогенеза были четко определены. Клетках зародышевой линии, которые развиваются синхронно в кисты прогрессировать последовательно через стадии сперматогенеза по длине яичка. Во время бого митотического и мейотических подразделений мужских половых клеток, цитокинез происходит не полностью, так что дочерние клетки остаются соединены цитоплазматическими мостиками, известных как кольцевых каналов (рис. 1). Верхушечный верхушка яичка содержит население зародышевой линии стволовых клеток, который дает начало сперматогониальных клеток, которые подвергаются четыре митотических делений с неполной цитокинезе генерировать 16-клеточные кисты первичных сперматоцитах. После премейотической S фазе, сперматоциты введите G2, длительный период роста ~ 90 час, в течение которого увеличивается сотовой объем ~ 25 раз. Прогрессирование через мейоза I и мейоз II приводит к образованию 32-клеточных кист средних сперматоцитах и ​​64-клеточных кист гаплоидных сперматидах, соответственно. Незрелые, круглые сперматиды проходят обширные сотовой ремоделирования сформировать зрелые сперматозоиды. После мейоза клетки, в частности пучки удлинения и зрелые сперматиды, занимают большую часть объема яичка.

Тон успешно транспорт функциональной спермы в женских мух требует координации между различными частями мужской репродуктивной системы, которая состоит из нескольких парных структур (яичек, семенных пузырьков, и придаточных желез) и одной эякуляции протока (рис. 2). Сперматозоиды производятся в яичках и хранятся в семенных пузырьков, пока совокупления ^24. Акцессорные железы содержат секреторные клетки, которые производят семенной жидкости. Сперма миграции из семенных пузырьков смешиваются с семенной жидкости внутри эякуляции канал, который соединен с обеих семенных пузырьков и придаточных желез. Эта смесь спермы и семенной жидкости, в конечном счете откачивают из самца во влагалище самки летать через эякуляции лампы, расположенной на заднем конце охватываемой части живота ^25. Белки в пределах семенной жидкости имеют важное значение для длительного хранения спермы в специализированных органов, известных как сперматеки в респroductive тракт Drosophila женщин ^26.

Отличные методы изоляции дрозофилы яичек и визуализации клеток на разных стадиях сперматогенеза доступны в научной литературе ^3-12. Здесь мы добавить к этому совокупность знаний, представляя примеры этих протоколов с сопровождающим видео демонстрации. Протокол для подготовки проб живые яичек для фазово-контрастной микроскопии основан на описанным ранее методом ^27. Протокол формальдегида фиксации и иммунным окрашиванием семенников также основано на ранее описанного метода ^28. Подходы, описанные здесь, были использованы во многих исследованиях Drosophila сперматогенеза (например, для оценки роли динеина, микротрубочек двигатель минус-конец-направленный, в течение Drosophila сперматогенеза).

В дополнение к основным протоколов, предложения предусмотрены для varyinг рассечение с целью обогащения для сперматогониев, сперматоцитах или зрелой спермы. Различные методы обработки яички такие, что кисты либо остаются нетронутыми или нарушается по мере необходимости описаны. Преимущество использования Drosophila яички в качестве модельной системы является то, что, по сравнению с Drosophila ооцитов и эмбрионов, антитела и красители могут легко проникают в клетки после их разгона от семенников, и незначительное промывание требуется, таким образом, протоколы могут быть выполнены в относительно короткое время.

Protocol

1. Семенники Рассечение Обезболить мух в бутылку или флакон с помощью потока СО 2 и трансфер в лету площадку. Сортировать летает под микроскопом рассекает используя маленькую кисть, и собрать соответствующее количество (в зависимости от эксперимента) от дрозофилы …

Representative Results

Пример правильно расчлененного пары дрозофилы мужских половых органов показано на рисунке 2А. Семенники удалены из брюшной полости взрослого мужского лету, как правило, прилагается к эякуляции протока (коричневый, рис. 2А ") и парой придаточных желез (зеленый, <s…

Discussion

Хотя яички мух дикого типа могут быть легко идентифицированы за счет их желтого цвета (в отличие соседних белых тканей), яички белых мутантных мух белые и таким образом может иногда путать с кишечнике. Большинство трансгенных линий, которые обычно в белом фоне, также есть белы?…

Materials

Sylgard	World Precision Instruments	SYLG184	Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen	Fisher Scientific	NC9888126	Ted Pella #22309
Clear nail protector	Wet n Wild	7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88)	Sigma-Aldrich	T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-165-003
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Ethanol	Fisher Scientific	AC61511-0040
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
16% Formaldehyde	Thermo Fisher Scientific	28908
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2	Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI	Sigma-Aldrich	D-9542	0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20°C
NaCl	Research Products International Corp.	S23020
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S9763
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
Kimwipes delicate task wipers	Fisher Scientific	S47299
BSA	Research Products International Corp.	A30075	Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap	Electron Microscopy Sciences	70315
Single frosted microscope slides	Corning	2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides	Polysciences, Inc.	22247-1	Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass	Corning	2865-22
Razor blades	Fisher Scientific	12-640
Kimax Petri dish	Fisher Scientific	S31473	Kimble #23060 10015 EMD
Forceps	Dumont	52100-51S	Pattern 5 INOX
Name of Equipment	Company
Stemi 2000-CS stereoscope	Carl Zeiss
Eclipse 80i	Nikon
Plan-Fluor 40x objective	Nikon
Axiophot	Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40x objective	Carl Zeiss