Cytologique Analyse de la spermatogenèse: Préparatifs en direct et fixes de<em> Drosophila</em> Testicules
Summary
Méthodes pour isoler et préparer Drosophila testicules échantillons (vivre et fixe) pour l'imagerie par contraste de phase et microscopie de fluorescence sont décrits ici.
Abstract
Drosophila melanogaster est un système de modèle puissant qui a été largement utilisé pour élucider une variété de processus biologiques. Par exemple, des études à la fois la femme et lignées germinales mâles de Drosophila ont grandement contribué à la compréhension actuelle de la méiose ainsi que la biologie des cellules souches. Excellentes protocoles sont disponibles dans la littérature pour l'isolement et l'imagerie de ovaires et les testicules 12.03 Drosophila. Ici, les méthodes pour la dissection et la préparation des testicules chez la drosophile pour l'analyse microscopique sont décrits avec une vidéo de démonstration d'accompagnement. Un protocole pour isoler les testicules de l'abdomen des mâles adultes et préparer des lames de tissu vivant pour une analyse par microscopie à contraste de phase ainsi que d'un protocole pour la fixation et la coloration immunologique testicules pour l'analyse par microscopie de fluorescence sont représentés. Ces techniques peuvent être appliquées à la caractérisation de mutants de drosophile qui présentent defects de la spermatogenèse, ainsi que dans la visualisation des localisations intracellulaires de protéines.
Introduction
Testicules chez la drosophile sont un système modèle idéal pour l'étude de nombreux processus biologiques, y compris la régulation des cellules souches, la méiose, et le développement des spermatozoïdes 13-18. Les spermatocytes et leurs fuseaux méiotiques sont grandes et donc pratique pour l'analyse cytologique, et les points de contrôle du cycle cellulaire détendu pendant la spermatogenèse faciliter l'étude des mutations dans les gènes du cycle cellulaire. Différents types de cellules peuvent être observées dans la progression ordonnée le long de la longueur des testicules, et toute perturbation de la spermatogenèse peuvent conduire à des changements dans cet agencement global. Ces fonctionnalités, combinées à des outils génétiques chez la drosophile ont facilité l'analyse mutationnelle de la spermatogenèse 21-23.
Les étapes de la spermatogenèse chez la drosophile ont été bien définis. des cellules de la lignée germinale qui se développent de manière synchrone à l'intérieur des kystes progresser séquentiellement à travers les étapes de la spermatogenèse le long de la longueur du testicule. Pendant boe la mitose et la méiose divisions des cellules germinales mâles, la cytokinèse se produit de manière incomplète de telle sorte que les cellules filles restent reliés par des ponts cytoplasmiques dits canaux périphériques (Figure 1). L'extrémité apicale du testicule contient une population de cellules souches de lignée germinale qui donne lieu à des spermatogonies, qui subissent quatre divisions mitotiques avec la cytokinèse incomplète pour générer des kystes de 16 cellules de spermatocytes primaires. Après la phase S préméiotique, spermatocytes primaires entrent G2, une période de croissance prolongée de ~ 90 heures au cours de laquelle le volume cellulaire augmente ~ 25 fois. La progression à travers la méiose et de la méiose II I conduit à la formation de kystes de 32 cellules de spermatocytes secondaires et les kystes 64 cellulaires des spermatides haploïdes, respectivement. Les immatures, des spermatides rondes subissent un remodelage cellulaire pour former des spermatozoïdes matures. Cellules post-méiotiques, en particulier des faisceaux de s'allongeant et spermatides matures, occupent une grande partie du volume du testicule.
Til transports succès des spermatozoïdes fonctionnels à mouches femelles nécessite une coordination entre les différentes parties du système reproducteur masculin, qui est composé de plusieurs structures paires (les testicules, les vésicules séminales et des glandes accessoires) et un seul canal éjaculateur (Figure 2). Les spermatozoïdes sont produits dans les testicules et stockée dans les vésicules séminales jusqu'à l'accouplement 24. Les glandes accessoires contiennent des cellules sécrétoires qui produisent le liquide séminal. Le sperme migrer des vésicules séminales sont mélangés avec le liquide séminal dans le conduit éjaculatoire, qui est reliée à la fois les vésicules séminales et les glandes accessoires. Ce mélange de sperme et du liquide séminal est finalement pompé hors du mâle dans le vagin de la femelle voler à travers l'ampoule de la éjaculatoire situé à l'extrémité postérieure de l'abdomen mâle 25. Protéines dans le liquide séminal sont essentiels pour un stockage prolongé des spermatozoïdes dans les organes spécialisés appelés spermathèque de la répétitionvoies roductive de Drosophila femmes 26.
D'excellentes méthodes pour l'isolement de testicules de Drosophila et la visualisation de cellules à différents stades de la spermatogenèse sont disponibles dans la littérature scientifique 3-12. Nous ajoutons ici à cet ensemble de connaissances en présentant des exemples de ces protocoles avec une vidéo de démonstration d'accompagnement. Le protocole de préparation des échantillons de testicules vivants pour la microscopie à contraste de phase est basé sur un procédé 27 décrit précédemment. Le protocole pour la fixation de formaldehyde et immunomarquage des testicules est également basée sur un procédé 28 décrit précédemment. Les approches décrites ici ont été utilisées dans de nombreuses études de la spermatogenèse chez la drosophile (par exemple, pour évaluer le rôle de la dynéine, un moteur de microtubule-minus extrémité dirigée, pendant la spermatogenèse chez la drosophile).
En plus des protocoles de base, des suggestions sont prévus pour varying la dissection afin d'enrichir de spermatogonies, spermatocytes, ou des spermatozoïdes matures. Différentes méthodes de traitement des testicules tels que les kystes soit restent intacts ou sont perturbés au besoin sont décrits. Un avantage à utiliser des testicules de Drosophila en tant que système modèle est que, par rapport à des ovocytes et des embryons de Drosophila, des anticorps et des colorants peuvent facilement pénétrer dans les cellules après leur dispersion à partir des testicules, et moins d'étapes de lavage sont nécessaires, ainsi, les protocoles peuvent être effectuées en un temps relativement peu de temps.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que les testicules des mouches de type sauvage peuvent être facilement identifiés en raison de leur couleur jaune (en revanche, les tissus blancs des voisins), les testicules des mouches mutantes blancs sont blancs et donc peuvent parfois être confondus avec l'intestin. La plupart des souches transgéniques, qui sont généralement dans un fond blanc, ont également testicules blancs parce que le gène de mini-blanc trouvé dans les P-éléments ne favorise pas l'accum…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Michael Anderson pour établir dans le laboratoire Lee ces méthodes reconnues pour l'étude de la spermatogenèse des conseils d'experts de Karen Hales. H. Oda et Y. Akiyama-Oda généreusement fourni le γ-tubuline-GFP mouche stock. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH R01 à LAL (GM074044).
Materials
| Sylgard | World Precision Instruments | SYLG184 | Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish |
| PAP pen | Fisher Scientific | NC9888126 | Ted Pella #22309 |
| Clear nail protector | Wet n Wild | 7780235001 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-003 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC61511-0040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 16% Formaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D-9542 | 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20°C |
| NaCl | Research Products International Corp. | S23020 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Kimwipes delicate task wipers | Fisher Scientific | S47299 | |
| BSA | Research Products International Corp. | A30075 | Molecular biology grade |
| Glass Coplin staining jar, screw cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 | |
| Single frosted microscope slides | Corning | 2948-75X25 | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Polysciences, Inc. | 22247-1 | Optional (to replace untreated microscope slides ) |
| Square cover glass | Corning | 2865-22 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Kimax Petri dish | Fisher Scientific | S31473 | Kimble #23060 10015 EMD |
| Forceps | Dumont | 52100-51S | Pattern 5 INOX |
| Name of Equipment | Company | ||
| Stemi 2000-CS stereoscope | Carl Zeiss | ||
| Eclipse 80i | Nikon | ||
| Plan-Fluor 40x objective | Nikon | ||
| Axiophot | Carl Zeiss | ||
| Plan-Neofluar Ph2 40x objective | Carl Zeiss |
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