शुक्राणुजनन की कोशिकीय विश्लेषण: की लाइव और फिक्स्ड तैयारी<em> ड्रोसोफिला</em> Testes
Summary
अलग और चरण विपरीत और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के लिए ड्रोसोफिला वृषण नमूने (रहते हैं और फिक्स्ड) तैयार करने के लिए तरीके के साथ साथ वर्णित हैं.
Abstract
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर व्यापक रूप से जैविक प्रक्रियाओं की एक किस्म को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है. उदाहरण के लिए, महिला और ड्रोसोफिला के पुरुष रोगाणु लाइनों दोनों की पढ़ाई चालू अर्धसूत्रीविभाजन की समझ के साथ ही स्टेम कोशिका जीव विज्ञान के लिए बहुत योगदान दिया है. बहुत बढ़िया प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला अंडाशय और वृषण 3-12 के अलगाव और इमेजिंग के लिए साहित्य में उपलब्ध हैं. इस के साथ साथ, सूक्ष्म विश्लेषण के लिए विच्छेदन और ड्रोसोफिला वृषण की तैयारी के लिए तरीके एक साथ वीडियो प्रदर्शन के साथ वर्णित हैं. वयस्क पुरुषों के पेट से वृषण अलग और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के साथ ही प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के लिए वृषण फिक्सिंग और immunostaining के लिए एक प्रोटोकॉल के लिए जीना ऊतक की स्लाइड तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत कर रहे हैं. इन तकनीकों में डी प्रदर्शन है कि ड्रोसोफिला म्यूटेंट के लक्षण वर्णन में लागू किया जा सकता हैशुक्राणुजनन में साथ ही साथ प्रोटीन की subcellular localizations के दृश्य में efects.
Introduction
ड्रोसोफिला वृषण स्टेम कोशिकाओं का विनियमन, अर्धसूत्रीविभाजन, और शुक्राणु विकास 13-18 सहित कई जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली रहे हैं. spermatocytes और उनके meiotic spindles बड़े और कोशिकीय विश्लेषण के लिए इसलिए सुविधाजनक हैं, और शुक्राणुजनन के दौरान आराम से सेल चक्र चौकियों सेल चक्र जीन में उत्परिवर्तन के अध्ययन की सुविधा. विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं वृषण की लंबाई के साथ आदेश दिया प्रगति में मनाया जा सकता है, और शुक्राणुजनन में कोई व्यवधान इस समग्र व्यवस्था में परिवर्तन हो सकता है. ड्रोसोफिला आनुवंशिक उपकरणों के साथ संयुक्त इन सुविधाओं शुक्राणुजनन 21-23 की उत्परिवर्तनीय विश्लेषण में मदद की है.
ड्रोसोफिला शुक्राणुजनन के चरणों में अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है. अल्सर के भीतर synchronously कि विकास जर्मलाइन कोशिकाओं वृषण की लंबाई के साथ शुक्राणुजनन के चरणों के माध्यम से क्रमिक रूप से प्रगति. बो के दौरानmitotic और पुरुष रोगाणु कोशिकाओं की meiotic डिवीजनों वें, cytokinesis बेटी कोशिकाओं (चित्रा 1) अंगूठी नहरों के रूप में जाना cytoplasmic पुलों से जुड़े रहते हैं कि अधूरे ऐसी होती है. वृषण के शिखर टिप प्राथमिक spermatocytes के 16 सेल अल्सर उत्पन्न करने के लिए अधूरा cytokinesis साथ चार mitotic डिवीजनों से गुजरना जो spermatogonial कोशिकाओं, को जन्म देता है कि germline स्टेम कोशिकाओं की आबादी शामिल है. Premeiotic एस चरण के बाद, प्राथमिक spermatocytes G2, ~ 90 घंटा जो सेलुलर मात्रा बढ़ जाती है ~ 25 गुना के दौरान की एक लम्बी विकास की अवधि में प्रवेश. अर्धसूत्रीविभाजन मैं और क्रमशः माध्यमिक spermatocytes और अगुणित spermatids के 64 सेल अल्सर, के 32 सेल अल्सर के गठन में अर्धसूत्रीविभाजन II परिणामों के माध्यम से प्रगति. अपरिपक्व, गोल spermatids परिपक्व शुक्राणु के लिए फार्म का व्यापक सेलुलर remodeling गुजरना. पोस्ट meiotic कोशिकाओं, elongating के बंडलों और परिपक्व spermatids विशेष रूप से, वृषण की मात्रा का ज्यादा कब्जा करना था.
टीमादा मक्खियों के लिए कार्यात्मक शुक्राणु की वह सफल परिवहन कई बनती संरचनाओं (वृषण, लाभदायक vesicles, और सहायक ग्रंथियों) और एक भी उद्गार वाहिनी से बना है जो पुरुष प्रजनन प्रणाली, चित्रा (2) के विभिन्न भागों के बीच समन्वय की आवश्यकता है. शुक्राणु वृषण भीतर उत्पादन और शयन 24 तक लाभदायक vesicles के भीतर जमा हो जाती है. सहायक ग्रंथियों लाभदायक तरल पदार्थ का उत्पादन है कि स्रावी कोशिकाओं होते हैं. लाभदायक vesicles से पलायन शुक्राणु लाभदायक vesicles और सहायक ग्रंथियों दोनों से जुड़ा है जो उद्गार वाहिनी, भीतर लाभदायक तरल पदार्थ के साथ मिश्रित कर रहे हैं. शुक्राणु और लाभदायक तरल पदार्थ के मिश्रण यह अंततः महिला पुरुष के पेट से 25 के पीछे के अंत में स्थित उद्गार बल्ब के माध्यम से उड़ान भरने की योनि में पुरुष के बाहर पंप है. लाभदायक तरल पदार्थ के भीतर प्रोटीन प्रतिनिधि में spermathecae के रूप में जाना विशेष अंगों के भीतर शुक्राणु के लंबे समय तक भंडारण के लिए आवश्यक हैंड्रोसोफिला महिलाओं की 26 roductive पथ.
ड्रोसोफिला वृषण का अलगाव और शुक्राणुजनन के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं के दृश्य के लिए बहुत बढ़िया तरीकों वैज्ञानिक साहित्य 3-12 में उपलब्ध हैं. हम यहाँ एक साथ वीडियो प्रदर्शन के साथ इन प्रोटोकॉल का उदाहरण पेश करके ज्ञान के इस शरीर को जोड़ें. चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के लिए जीना वृषण नमूनों की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल एक पहले से वर्णित विधि 27 पर आधारित है. formaldehyde के निर्धारण और वृषण के immunostaining के लिए प्रोटोकॉल भी एक पहले से वर्णित विधि 28 पर आधारित है. यहाँ बताया दृष्टिकोण (उदाहरण के लिए, ड्रोसोफिला शुक्राणुजनन के दौरान, एक शून्य से अंत निर्देशित microtubule मोटर dynein की भूमिका का आकलन करने के लिए) ड्रोसोफिला शुक्राणुजनन के कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है.
बुनियादी प्रोटोकॉल के अलावा, सुझाव varyin के लिए प्रदान की जाती हैंजी विच्छेदन spermatogonia, spermatocytes, या परिपक्व शुक्राणु के लिए समृद्ध करने के लिए इतनी के रूप में. इस तरह के अल्सर कि वृषण प्रसंस्करण के लिए विभिन्न तरीकों बरकरार रहेगा या वर्णित हैं जरूरत के रूप में बाधित कर रहे हैं. एक मॉडल प्रणाली के रूप में ड्रोसोफिला वृषण का उपयोग में एक फायदा ड्रोसोफिला oocytes और भ्रूण की तुलना में, एंटीबॉडी और रंजक आसानी वृषण से उनके प्रसार निम्नलिखित कोशिकाओं घुसना कर सकते हैं, और कम धोने कदम जरूरी हैं, वह है, इस प्रकार, प्रोटोकॉल एक अपेक्षाकृत में प्रदर्शन किया जा सकता है कम समय.
Protocol
Representative Results
Discussion
जंगली प्रकार मक्खियों के वृषण आसानी के कारण उनके पीले रंग (इसके विपरीत पड़ोसी सफेद ऊतकों) को पहचाना जा सकता है, सफेद उत्परिवर्ती मक्खियों के वृषण सफेद होते हैं और इस तरह कभी – कभी पेट के साथ भ्रमित कि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ली प्रयोगशाला में करेन हेल्स से विशेषज्ञ सलाह के साथ शुक्राणुजनन के अध्ययन के लिए इन स्वीकार किए जाते हैं तरीकों की स्थापना के लिए माइकल एंडरसन को धन्यवाद देना चाहूंगा. एच. ओडीए और वाई Akiyama-ओडीए उदारता γ ट्यूबिलिन-GFP शेयर उड़ प्रदान की. इस काम के लाल (GM074044) के लिए एक एनआईएच R01 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Sylgard | World Precision Instruments | SYLG184 | Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish |
| PAP pen | Fisher Scientific | NC9888126 | Ted Pella #22309 |
| Clear nail protector | Wet n Wild | 7780235001 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-003 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC61511-0040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 16% Formaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D-9542 | 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20°C |
| NaCl | Research Products International Corp. | S23020 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Kimwipes delicate task wipers | Fisher Scientific | S47299 | |
| BSA | Research Products International Corp. | A30075 | Molecular biology grade |
| Glass Coplin staining jar, screw cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 | |
| Single frosted microscope slides | Corning | 2948-75X25 | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Polysciences, Inc. | 22247-1 | Optional (to replace untreated microscope slides ) |
| Square cover glass | Corning | 2865-22 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Kimax Petri dish | Fisher Scientific | S31473 | Kimble #23060 10015 EMD |
| Forceps | Dumont | 52100-51S | Pattern 5 INOX |
| Name of Equipment | Company | ||
| Stemi 2000-CS stereoscope | Carl Zeiss | ||
| Eclipse 80i | Nikon | ||
| Plan-Fluor 40x objective | Nikon | ||
| Axiophot | Carl Zeiss | ||
| Plan-Neofluar Ph2 40x objective | Carl Zeiss |
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