Cytologisk analys av Spermatogenesen: Live och fasta Beredningar av<em> Drosophila</em> Testiklar

Summary

Metoder för att isolera och förbereda Drosophila testiklar prover (levande och fast) för avbildning av fas-kontrast och fluorescensmikroskopi beskrivs här.

Abstract

Drosophila melanogaster är en kraftfull modellsystem som har använts i stor omfattning för att belysa en mängd olika biologiska processer. Till exempel har studier av både kvinnliga och manliga könslinjer Drosophila hög grad bidragit till den nuvarande förståelsen av meios och stamcellsbiologi. Utmärkt protokoll finns tillgängliga i litteraturen för isolering och avbildning av Drosophila äggstockar och testiklar ^3-12. Häri finns metoder för dissekering och beredning av Drosophila testiklar för mikroskopisk analys beskrivs med en medföljande video demonstration. Ett protokoll för att isolera testiklar från buken av vuxna män och förbereda diabilder av levande vävnad för analys av fas-kontrast mikroskopi samt ett protokoll för fixering och immunfärgning testiklar för analys av fluorescensmikroskopi presenteras. Dessa tekniker kan användas i karaktäriseringen av Drosophila mutanter som uppvisar defects i spermatogenes liksom i visualiseringen av subcellulära lokaliseringar av proteiner.

Introduction

Drosophila testiklar är ett perfekt modellsystem för studier av många biologiska processer, inklusive regleringen av stamceller, meios och spermier utveckling ^13-18. De spermatocyter och deras meiotiska spindlarna är stora och därmed bekvämt för cytologisk analys och avslappnade cellcykelkontrollpunkter under spermatogenes lätta studier av mutationer i cellcykelgener. Olika celltyper kan observeras i beställas progression längs testiklarna, och eventuella störningar i spermatogenesen kan leda till förändringar i denna övergripande överenskommelse. Dessa egenskaper i kombination med Drosophila genetiska verktyg har underlättat mutationsanalys av spermatogenes ^21-23.

Stegen i Drosophila spermatogenes har väl definierade. Nedärvda celler som utvecklas synkront inom cystor utvecklas sekventiellt genom de olika stadierna av spermatogenes längs längden av testiklarna. Under both den mitotiska och meiotiska divisioner av de manliga könsceller, sker cytokines ofullständigt så att dottercellerna förbli anslutna genom cytoplasma broar kallas ring kanaler (figur 1). Den apikala spetsen av testikel innehåller en population av nedärvda stamceller som ger upphov till spermatogoniala celler, som undergår fyra mitotiska delningar med ofullständig cytokines för att generera 16-cell-cystor av primära spermatocyter. Efter premeiotic S-fasen, primära spermatocyter anger G2, en längre tillväxtperiod på ~ 90 timmar, under vilken cellvolymökningar ~ 25-faldigt. Progression genom meios I och meios II resulterar i bildning av 32-cell cystor av sekundära spermatocyter och 64-cell-cystor av haploida spermatider resp. De omogna, runda spermatider genomgår omfattande cellulära ombyggnad för att bilda mogna spermier. Post-meiotiska celler, särskilt buntar av förlängning och mogna spermatider, upptar en stor del av volymen av testiklarna.

Than framgångsrik transport av funktionell sperma till kvinnliga flugor kräver samordning mellan de olika delarna av det manliga reproduktiva systemet, som består av flera ihopkopplade strukturer (testiklarna, sädesblåsorna och tillbehör körtlar) och en enda ejakulation kanal (figur 2). Spermier produceras i testiklarna och lagras i sädesblåsorna tills parning ^24. Tillbehörs körtlar innehåller sekretoriska celler som producerar sädesvätska. Spermierna migrerar från sädesblåsorna blandas med sädesvätska inom ejakulation kanal som är ansluten till båda sädesblåsorna och de accessoriska körtlarna. Denna blandning av sperma och sädesvätska slutligen pumpas ut av den manliga i vagina av den kvinnliga flyga genom ejakulation glödlampa placerad vid den bakre änden av den manliga buken ^25. Proteiner i sädesvätskan är avgörande för långvarig lagring av sperma inom specialiserade organ som kallas spermathecae i reproductive kanalen hos Drosophila honor ^26.

Utmärkta metoder för isolering av Drosophila testiklar och visualisering av celler i olika stadier av spermatogenesen finns i den vetenskapliga litteraturen ^3-12. Vi lägger här till denna samlade kunskap genom att presentera exempel på dessa protokoll med en medföljande video demonstration. Protokollet för framställning av levande testiklar prover för faskontrastmikroskopi är baserad på en tidigare beskriven metod ^27. Protokollet för formaldehydfixering och immunfärgning av testiklarna är också baserad på en tidigare beskriven metod ^28. De metoder som beskrivs här har använts i många studier av Drosophila spermatogenesen (t.ex. för att bedöma de roller dynein, ett minus-end-riktad mikrotubuli motor, under Drosophila spermatogenesen).

Förutom de grundläggande protokollen ges förslag anges varying dissektion för att berika för spermatogonier, spermatocyter eller mogna spermier. Olika metoder för behandling av testiklarna sådana att cystor antingen förbli intakt eller störs behov beskrivs. En fördel med att använda Drosophila testiklar som ett modellsystem är att, jämfört med Drosophila-oocyter och embryon kan antikroppar och färgämnen lätt penetrera celler efter att de är spridda från testiklarna, och färre tvättsteg erfordras, och därför kan protokollen utföras i en relativt kort tid.

Protocol

1. Testiklar Dissection Söva flugor i en flaska eller ampull med hjälp av en ström av CO2 och överför till en fluga dyna. Sortera flugor under ett dissektionsmikroskop med användning av en liten målarpensel, och samla in ett lämpligt antal (beroende på provet) av Drosophila hanar av de önskade genotyper. Unga män (0-2 dagar gamla) är idealiska för att undersöka celler under tidigare stadier av spermatogenesen (t.ex. spermatogonier, spermatocyter, och tidiga…

Representative Results

Ett exempel på ett korrekt dissekerades par Drosophila manliga reproduktionsorgan visas i fig. 2A. Testiklar avlägsnades från buken av den vuxna manliga flugan är vanligtvis fäst vid ejakulation kanalen (brun, figur 2A) och ett par av accessoriska körtlarna (grön, figur 2A) via ett par sädesblåsor (blå, figur 2A) . För att separera testiklarna från de flesta av den åtföljande somatisk vävnad, ejaculatorius kanalen och de accessor…

Discussion

Även om testiklarna av vildtyp flugor kan lätt identifieras på grund av sin gula färg (i kontrast grann vita vävnader), testiklarna av vita muterade flugor är vita och därför kan ibland förväxlas med tarmen. De flesta transgena stammar, som vanligtvis är i en vit bakgrund, har också vita testiklar eftersom mini-vita gen som finns i P-element inte främjar pigment ackumulering i testiklarna. När Drosophila testiklar inte kan särskiljas genom färg, andra lätt ig…

Materials

Sylgard	World Precision Instruments	SYLG184	Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen	Fisher Scientific	NC9888126	Ted Pella #22309
Clear nail protector	Wet n Wild	7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88)	Sigma-Aldrich	T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-165-003
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Ethanol	Fisher Scientific	AC61511-0040
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
16% Formaldehyde	Thermo Fisher Scientific	28908
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2	Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI	Sigma-Aldrich	D-9542	0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20°C
NaCl	Research Products International Corp.	S23020
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S9763
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
Kimwipes delicate task wipers	Fisher Scientific	S47299
BSA	Research Products International Corp.	A30075	Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap	Electron Microscopy Sciences	70315
Single frosted microscope slides	Corning	2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides	Polysciences, Inc.	22247-1	Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass	Corning	2865-22
Razor blades	Fisher Scientific	12-640
Kimax Petri dish	Fisher Scientific	S31473	Kimble #23060 10015 EMD
Forceps	Dumont	52100-51S	Pattern 5 INOX
Name of Equipment	Company
Stemi 2000-CS stereoscope	Carl Zeiss
Eclipse 80i	Nikon
Plan-Fluor 40x objective	Nikon
Axiophot	Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40x objective	Carl Zeiss