Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em> Drosophila</em> Testisler
Summary
Izole edilmesi ve faz kontrast ve floresan mikroskobu ile görüntüleme için Drosophila testis örnekleri (canlı ve sabit) hazırlanması için yöntemler burada tarif edilmiştir.
Abstract
Drosophila melanogaster yaygın olarak biyolojik süreçlerin çeşitli aydınlatmak için kullanılmış olan güçlü bir model sistem. Örneğin, kadın ve Drosophila erkek germ hatlarının hem de çalışmaları mevcut mayoz anlayış yanı sıra kök hücre biyolojisi büyük ölçüde katkıda bulunmuştur. Mükemmel protokolleri Drosophila yumurtalık ve testis 3-12 izolasyonu ve görüntüleme için literatürde mevcuttur. Burada, mikroskobik analiz için diseksiyon ve Drosophila testis hazırlanması için yöntemler, eşlik eden bir video gösterimi ile tarif edilmiştir. Yetişkin erkeklerin karından testisler izole edilmesi ve faz kontrast mikroskopisi ile analiz hem de floresan mikroskobu ile analiz için sabitleme testisler ve immünboyama için bir protokol için canlı doku slaytlar hazırlanması için bir protokol sunulmaktadır. Bu teknikler, d gösteren Drosophila mutantlar karakterizasyonunda uygulanabilirspermatogenezde yanı sıra, proteinlerin hücre içi yerleşimlerin görselleştirme efects.
Introduction
Drosophila testis kök hücrelerin düzenlenmesi, mayoz, ve sperm gelişimi 13-18 dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçlerin çalışma için ideal bir model sistem. Spermatosit ve öz değişmesine ait iğ büyük ve sitolojik analiz için bu nedenle uygun olan ve spermatogenez sırasında rahat bir hücre döngüsü kontrol noktası hücre döngüsü genlerdeki mutasyonların çalışma kolaylaştırır. Farklı hücre tipleri testislerin uzunluğu boyunca düzenli ilerleme gözlenebilir, spermatogenez ve herhangi bir bozulma bu genel düzenleme değişikliklere yol açabilir. Drosophila genetik araçlar ile birlikte bu özellikler, spermatogenez 21-23 mutasyonel analiz kolaylaştırmıştır.
Drosophila Spermatogenezin evreleri çok iyi tanımlanmıştır. Kistlerinin içinde eşzamanlı geliştirmek Germline hücreleri testis uzunluğu boyunca spermatogenez aşamalarında sırayla ilerleme. Bo sırasındamitoz ve erkek germ hücrelerinin miyoza bölünmeler inci, sitokinez kızı hücreleri (Şekil 1) halka kanallar olarak bilinen sitoplazmik köprülerle bağlı kalmasını eksik böyle oluşur. Testisin apikal uç birincil spermatositlerin 16-hücre kistler oluşturmak için eksik sitokinez dört mitotik bölünmeleri geçmesi spermatogonial hücreleri doğurur germ kök hücrelerin bir nüfus içerir. Premeiotic S aşamasından sonra, birincil spermatosit G2, ~ 90 saat hangi hücresel hacmi artar ~ 25 kat sırasında uzun bir büyüme dönemine giriyoruz. Mayoz I ve sırasıyla ikincil spermatositlerin ve haploid spermatidlerin 64-hücreli kist, 32-hücreli kist oluşumu mayoz II sonuçları yoluyla ilerleme. Olgunlaşmamış, yuvarlak spermatidlere olgun sperm oluşturmak için kapsamlı hücresel yeniden geçmesi. Post-öz değişmesine ait hücreler, uzatma demetleri ve olgun spermatidler özellikle, testis hacminin çok işgal.
Tdişi sinek fonksiyonel sperm o başarılı taşıma birkaç eşleştirilmiş yapıların (testisler, seminal kesecikler ve aksesuar bezleri) ve tek bir boşalma yolunun oluşan erkek üreme sistemi, (Şekil 2) farklı parçaları arasındaki koordinasyonu gerektirir. Sperm testislerde içinde üretilen ve çiftleşme 24 kadar seminal keseler içinde saklanır. Aksesuar bezleri seminal sıvıyı üreten salgı hücreleri içerir. Seminal veziküllerin göç sperm seminal keseler ve aksesuar bezleri hem de bağlı olduğu ejakülasyon kanal içerisindeki seminal sıvı ile karıştırılır. Sperm ve seminal sıvı Bu karışım sonuçta kadın erkek karın 25 arka ucunda bulunan ejakülasyon ampul sayesinde sinek vajina içine erkek dışarı pompalanır. Seminal sıvı içinde Proteinler rep spermatekada olarak bilinen uzman organların içinde sperm uzun süreli depolama için gerekli olanDrosophila kadın 26 roductive yolu.
Drosophila testislerin izolasyonu ve spermatogenez çeşitli aşamalarında hücreleri görselleştirilmesi için mükemmel yöntemler bilimsel literatürde 3-12 mevcuttur. Biz burada beraberindeki video gösterimi ile bu protokollerin örnekleri sunarak bu bilgi gövdesine ekleyin. Faz-kontrast mikroskopi için canlı testis numunelerin hazırlanması için protokol daha önce tarif edilen yönteme 27 dayanmaktadır. Formaldehit tespit ve testislerde immün için protokol, aynı zamanda, daha önce tarif edilen metodu takip 28 dayanmaktadır. Burada tarif edilen yaklaşımlar, (örneğin, Drosophila spermatogenez sırasında, bir eksi uç yönlendirilmiş mikrotübül motoru dinein rollerini değerlendirmek için) Drosophila spermatogenez birçok çalışmada kullanılmıştır.
Temel protokol ek olarak, öneri varyin verilmektedirg diseksiyon spermatogonia spermatositler, ya da olgun sperm için zenginleştirecek şekilde. Bu kistlerin ki testisler işlenmesi için farklı yöntemler bozulmadan kalması ya da tarif edilmektedir gerektiği gibi bozulur ya. Bir model sistem olarak Drosophila testisler kullanılmasının bir avantajı, Drosophila oositler ve embriyolar ile karşılaştırıldığında, antikorlar ve boyalar kolayca testis kendi dağılımı aşağıdaki hücreleri nüfuz edebilir ve daha az sayıda yıkama adımları gereklidir, yani, bu yüzden, protokoller nispeten gerçekleştirilebilir kısa bir süre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vahşi tip sinekler testisler kolayca nedeniyle sarı renk (aksine komşu beyaz dokular) ile tespit edilebilir, ancak beyaz sinek mutant testisler beyazdır ve bu nedenle zaman zaman gut ile karışabilir. P-elemanları bulunan beyaz mini-gen testislerde pigment birikimini teşvik etmez, çünkü beyaz bir arka planda genellikle çoğu transgenik suşları, aynı zamanda beyaz testisler var. Drosophila testisler renk ile ayırt edilemeyen zaman, diğer kolayca tanınabilir ö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Lee laboratuarda Karen Hales uzman tavsiyesi ile spermetogenez eğitim için kabul edilen bu yöntemlerin kurulması için Michael Anderson teşekkür etmek istiyorum. H. Oda ve Y. Akiyama-Oda cömertçe γ-tubulin-GFP stok sinek sağladı. Bu çalışma LAL (GM074044) bir NIH R01 hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Sylgard | World Precision Instruments | SYLG184 | Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish |
| PAP pen | Fisher Scientific | NC9888126 | Ted Pella #22309 |
| Clear nail protector | Wet n Wild | 7780235001 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-003 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC61511-0040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 16% Formaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D-9542 | 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20°C |
| NaCl | Research Products International Corp. | S23020 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Kimwipes delicate task wipers | Fisher Scientific | S47299 | |
| BSA | Research Products International Corp. | A30075 | Molecular biology grade |
| Glass Coplin staining jar, screw cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 | |
| Single frosted microscope slides | Corning | 2948-75X25 | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Polysciences, Inc. | 22247-1 | Optional (to replace untreated microscope slides ) |
| Square cover glass | Corning | 2865-22 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Kimax Petri dish | Fisher Scientific | S31473 | Kimble #23060 10015 EMD |
| Forceps | Dumont | 52100-51S | Pattern 5 INOX |
| Name of Equipment | Company | ||
| Stemi 2000-CS stereoscope | Carl Zeiss | ||
| Eclipse 80i | Nikon | ||
| Plan-Fluor 40x objective | Nikon | ||
| Axiophot | Carl Zeiss | ||
| Plan-Neofluar Ph2 40x objective | Carl Zeiss |
References
- McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries. Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila Protocols. , 87-109 (2000).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Preparation of live testis squashes in Drosophila. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Formaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. F-actin staining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).
- Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).
- Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell. Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).
- Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster Testes. J. Vis. Exp. (2641), (2011).
- de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
- Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
- Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. Cytokinesis in Drosophila male meiosis. Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).
- Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology. Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).
- McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. Meiosis in male Drosophila. Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).
- Zoller, R., Schulz, C. The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes. Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).
- Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).
- Rebollo, E., Gonzalez, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).
- Castrillon, D. H., et al. Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis. Genetics. 135, 489-505 (1993).
- Giansanti, M. G., et al. Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males. Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).
- Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 207-216 (2004).
- Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. . The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).
- Wolfner, M. F. Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products. Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).
- Tram, U., Wolfner, M. F. Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster. Genetics. 153, 837-844 (1999).
- Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene. Cell. 21, 445-451 (1980).
- Gunsalus, K. C., et al. Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis. J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).
- Anderson, M. A., et al. Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis. Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).
- Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis. Development. 139, 2945-2954 (2012).
- Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila. Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J. Vis. Exp. (10), (2011).
- Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster. Genet. Res. 54, 205-212 (1989).
- Liebrich, W. The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study. Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).
- Wong, R., et al. PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes. Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- White-Cooper, H. Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).
- Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biol. 2, (2004).
- Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).
- Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
- Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).
- Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes. Development. 138, 3835-3845 (2011).
- Wang, Z., Mann, R. S. Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis. Development. 130, 2853-2865 (2003).
