Intramiocárdica celular de la entrega: Las observaciones en murinos Hearts

Summary

De suministro de células intramiocárdica en modelos murinos de enfermedades cardiovasculares, como la hipertensión o infarto de miocardio, es ampliamente utilizado para poner a prueba el potencial terapéutico de diferentes tipos de células en los estudios de regeneración. Por lo tanto, una descripción detallada y una visualización clara de este procedimiento quirúrgico ayudarán a definir los límites y las ventajas de los análisis de células terapéuticas cardiovasculares en pequeños roedores.

Abstract

Estudios previos mostraron que la entrega celular promueve la función cardíaca mejora por la liberación de citoquinas y factores que aumentan la revascularización del tejido cardiaco y la supervivencia celular. Además, otras observaciones revelaron que las células madre específicas, tales como las células madre cardíacas, células madre mesenquimales y cardioesferas tienen la capacidad de integrar dentro del miocardio circundante por diferenciarse en cardiomiocitos, células musculares lisas y células endoteliales.

A continuación, presentamos los materiales y métodos para la entrega fiable células contráctiles en la pared del ventrículo izquierdo de los ratones immunodepleted. Los pasos principales de este procedimiento microquirúrgico implican anestesia y la analgesia de inyección, intubación intratraqueal, incisión para abrir el pecho y exponer el corazón y la entrega de las células por una estéril aguja de calibre 30 y una jeringa de microlitro de precisión.

Procesamiento de tejidos que consiste en la recolección del corazón, embedding, seccionamiento y tinción histológica mostró que la inyección intramiocárdica de células produce un pequeño daño en la zona epicárdica, así como en la pared ventricular. Células no contráctiles fueron retenidos en la pared del miocardio de ratones inmunocomprometidos y fueron rodeados por una capa de tejido fibrótico, probablemente para proteger de la presión cardiaca y la carga mecánica.

Introduction

Varios protocolos de suministro de células se han probado en modelos murinos y de rata de enfermedades cardiovasculares con el fin de traducir la eficiencia, la eficacia y la seguridad de este procedimiento experimental en pacientes humanos. En pequeños corazones de roedores, de suministro de células intramiocárdica es el método más viable de suministro de células ^1,2, mientras que en el corazón de rata ³ anterógrada y retrógrada de infusión intracoronaria de células ⁴ también se puede utilizar. Ambos métodos tienen límites y ventajas. La entrega de la célula a través de la vía intracoronaria tiene ventajas teóricas sobre la inyección intramuscular directa en la promoción de la difusión de células mundial ^3, pero también tiene el riesgo de provocar embolia coronaria ^3,5. Limitaciones en la entrega intramyocardial están asociados con la lesión mecánica, inflamación aguda y ^6,7 daño miocárdico. En los seres humanos, las células para la reparación cardíaca son entregados por inyección intramiocárdica mediante un epicárdica endocárdica o quirúrgicoacercarse o por vía arterial intracoronaria ^8. Inyección de rutas transvasculares es adecuado en pacientes con infarto agudo de miocardio y la reperfusión, pero puede no ser posible en caso de oclusiones totales o mala circulación en los vasos del territorio efectuada ^9. La inyección directa en la pared ventricular por inyección transendocárdica o transepicárdico es técnicamente factible en función del estado de salud del paciente. De hecho, se ha demostrado que esta técnica es segura ^10,11, aunque para inyección transepicárdica es necesaria una cirugía abierta de tórax y para transendocárdico se acerca a un mapeo electrofisiológico para cada paciente es necesario para diferenciar los sitios de viables miocardio isquémico o cicatrices ^9.

Es importante destacar que, en los estudios de terapia celular la elección de la mejor célula para ser trasplantado está aún bajo investigación. Análisis a corto plazo (4 semanas) mostraron que la inyección de células madre cardiacas definidos como cardioesferas <shasta> 12 o células de población lateral de la médula ósea inducida por la ¹³ recuperación funcional cardiaca en murinos y de rata ^{14 15} modelos de infarto de miocardio por la disminución de tamaño de la cicatriz y la muerte celular. El trasplante alogénico de cardioesferas en un modelo de infarto de miocardio de rata sin inmunosupresión fue encontrado para ser seguro, promovió la regeneración cardiaca, y mejora la función del corazón a través de la estimulación de los mecanismos de reparación endógenos ^15. Lin-/c-kit + adultos células progenitoras en el corazón, se mostró a ser auto-renovación, clonogénico, y multipotentes in vitro e in vivo, y cuando se inyecta en un corazón de rata isquémico reconstituido grandes porciones de la pared del miocardio lesionado ¹⁶ y tenía la capacidad para formar las arterias coronarias conductora y de tamaño intermedio ^17. Estos datos prometedores alimentados en fase I y II de los ensayos clínicos en seres humanos: la inyección de las células madre mesenquimales autólogas y alogénicas (MSC) ^{18, 19} cardioesferas, o células madre cardíacas positivas c-Kit (CSC) 20 en isquémicas corazones humanos cada uno mostró efectos beneficiosos en la función cardiaca en estudios a largo plazo. Sin embargo, la amplia a largo plazo de seguimiento y retrospectivo meta-análisis demostraron que la terapia con células madre ofrece un beneficio significativo para algunos pacientes, pero no en otros, con una serie de resultados impredecibles ^21. Es posible que estas limitaciones se requerir el diseño de protocolos específicos de suministro de células para cada individuo y cada enfermedad.

En modelos de ratón y de rata, los estudios a largo plazo revelaron que la inyección de células no mejoró aún más la función cardíaca (12 meses). De hecho, los injertos de cardiomiocitos madre embrionarias humanas derivadas de células (hESC-CM) fueron en gran medida aisladas del miocardio acogida por una capa de tejido fibrótico ^22,23. Resultados similares se han observado tras el trasplante intramiocárdico de mioblastos esqueléticos en el corazón de ratones infartados ^24. FurthermoRe, la capacidad a largo plazo de las MSC alogénicas para preservar la función en el corazón infartado se ha limitado por la transición de una inmunoprivilegiado a un estado inmunogénica después de la diferenciación ^25.

Teniendo en cuenta los desafíos y las perspectivas señaladas anteriormente, se muestra aquí cómo entregar las células por inyección intramiocárdica en ratones. Observamos que las células sin propiedades contráctiles de cardiomiocitos no están conectados con el miocardio anfitrión y forman una masa cohesiva con una barrera delgada fibrótica. Aunque en algunos casos este resultado puede ser ventajoso, el siguiente análisis puede ser útil para entender cómo el injerto de células puede ser modulada para generar estructuras de miocardio funcionalmente conectados.

Protocol

Se realizaron todos los estudios con animales de conformidad con las normas internacionales (Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo) y nacional (UK Home Office, Ley 1986) regulaciones. Los procedimientos descritos en este documento son parte de nuestro plan de trabajo bajo licencia autoridades del Reino Unido y no se han llevado a cabo con el propósito de la grabación. 1. Preparación de las células Este protocolo describe la preparación de una línea celu…

Representative Results

Hemos inyectado células HEK293, que son distinguibles de las células del corazón por su diferente morfología (Figura 1), con una forma de adoquines en comparación con los cardiomiocitos alargados (Figura 1A). HEK293 células fueron más reactivas a colorante hematoxilina (color azul) en comparación con los cardiomiocitos (color rosa), probablemente debido a su contenido nuclear aumentó (Figura 1A). A fin de distinguir las células inyectadas desde el tejido del h…

Discussion

En este manuscrito, hemos demostrado cómo llevar a cabo la inyección intramiocárdica de células en corazones murinos. Como prueba de esta metodología, hemos utilizado células HEK293. Es importante destacar que las células HEK293 no se utilizan en cualquier estudio de terapia celular y por lo tanto los resultados de este manuscrito no son apropiados para la traducción directa a un enfoque terapéutico. Sin embargo, el hecho de que las células HEK293 no son células contráctiles y no transdiferenciarse en otros …

Materials

Isolator	Pfi systems	–	Quotation needed
Heating Pad	Vet Tech Solutions	HE006	For small animals
medetomidine	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
ketamine hydrochloride	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
atipamezole	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
Hair removal cream	Commercial shops	–
buprenorphine	NVS	–	Veterinary prescription is necessary
Leica MZFLIII microscope	Leica	Model S6E	With swing arm stand TS0
Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner	Hamamatsu	RS series
Scanning Electron Microscope	Jeol	JSM-6610
Blunt scissors	FST	14084-09
Minivent	Harvard apparatus	73-0043	Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)
Forceps	FST	11052-10
Retraction system	FST	18200-20	Kit for animals up to 200grams
30G 12mm; ½ inch	BBraun	A210	Fine yellow
microliter syringe	ESSLAB	81201	Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalogue number 83700
6-0 silk suture	Ethicon	W1614T