Intramyocardial Cell Levering: Observasjoner i murine Hearts

Summary

Intramyocardial celle levering i murine modeller av kardiovaskulære sykdommer, så som hypertensjon eller myokardialt infarkt, er mye brukt for å teste det terapeutiske potensial av forskjellige celletyper i regenerative studier. Derfor vil en detaljert beskrivelse og en klar visualisering av denne kirurgiske prosedyren bidra til å definere grensene og fordeler av hjerte-celle terapeutiske analysene i smågnagere.

Abstract

Tidligere studier viste at celle levering fremmer hjertefunksjon forbedring ved frigjøring av cytokiner og faktorer som øker hjertevevet revaskularisering og celle overlevelse. I tillegg er ytterligere observasjoner viste at bestemte stamceller, slik som hjerte-stamceller, mesenchymale stamceller og cardiospheres har evnen til å integrere i den omkringliggende hjertemuskelen ved å differensiere til kardiomyocytter, glatte muskelceller og endotelceller.

Her presenterer vi de materialer og metoder for å pålitelig levere noncontractile celler inn i venstre ventrikkel vegg av immunodepleted mus. De fremspringende trinn i denne fremgangsmåten involverer mikro anestesi og analgesi injeksjon, intratrakeal intubasjon, innsnitt for å åpne brystkassen og blottlegge hjertet og levering av celler av en steril 30-gauge nål og en presisjonsmikroliter sprøyte.

Tissue behandling bestående av hjerte høsting, embedding, snitting og histologisk farging viste at intramyocardial celleinjeksjon ga en liten skade i epicardial område, så vel som i den ventrikulære veggen. Noncontractile celler ble opprettholdt i den myokardial vegg av immunkompromitterte mus og var omgitt av et lag av fibrøst tissue, sannsynlighet for å beskytte mot kardial trykk og mekanisk belastning.

Introduction

Ulike celleleverings protokoller har blitt testet i murine og rottemodeller av hjerte-og karsykdommer med sikte på å oversette effektivitet, effekt og sikkerhet av denne eksperimentelle prosedyren hos mennesker. I små gnagere hjerter, er intramyocardial celle levering mest mulig metode for celle levering ^1,2, mens den i rottehjerte antegrad ³ og retrograd ^fire intracelle infusjon kan også anvendes. Begge metodene har begrensninger og fordeler. Cell levering intrakoronart har teoretiske fordeler fremfor direkte intramuskulær injeksjon i å fremme global celle formidling ^tre, men det har også risikoen for å forårsake koronar emboli ^3,5. Begrensninger på intramyocardial levering er forbundet med mekanisk skade, akutt betennelse, og hjerteinfarkt skader ^6,7. Hos mennesker er celler for hjerte reparasjon levert av intramyocardial injeksjon gjennom en endokardiale eller kirurgisk epikardialtnærme eller ved intra arteriell rute ^8. Injeksjon av transvascular ruter er egnet hos pasienter med akutt infarkt og reperfusert myokard, men kan ikke være mulig i tilfelle av total okklusjon eller dårlig flyt i blodårene i berørt område ^9. Direkte injeksjon inn i den ventrikulære veggen ved transendocardial eller transepicardial injeksjon er teknisk mulig, avhengig av pasientens helsetilstand. Faktisk har det vist seg at denne teknikken er trygt ^10,11, selv om det for transepicardial injeksjon en åpen bryst operasjon er nødvendig og for transendocardial nærmer seg en elektro kartlegging for hver pasient er nødvendig for å skille områder av levedyktige iskemisk eller arret ^9. myokardiet.

Viktigere, i celleterapi studier valget av den beste mobil å bli transplantert er fortsatt under etterforskning. Kortsiktige analyser (4 uker) viste at injeksjon av kardiale stamceller definert som cardiospheres <sopp> 12 eller side befolknings celler fra benmargen ¹³ indusert hjertestans funksjonell bedring i murine ¹⁴ og rotte ¹⁵ modeller av hjerteinfarkt ved å redusere arr størrelse og celledød. Allogen transplantasjon av cardiospheres i en rotte hjerteinfarkt modell uten immunsuppresjon ble funnet å være trygg, fremmet hjerte gjenfødelse, og forbedret hjertefunksjon gjennom stimulering av endogene reparasjonsmekanismene ^15. Lin-/c-kit + voksne stamceller i hjertet ble vist å være selvforsynt, clonogenic, og multipotent in vitro og in vivo, og når det injiseres en iskemisk rottehjerte rekonstruert store deler av den skadde hjerteinfarkt veggen ¹⁶ og hadde den evne til å danne ledende og mellomstore koronar arterier ^17. Disse lovende data drevet fase I og II kliniske studier på mennesker: injeksjon av autologe og allogene stamceller (MSC) ^18, cardiospheres ¹⁹eller c-Kit positive kardiale stamceller (CSC) 20 i iskemiske menneskers hjerter hver viste gunstige effekter i hjertefunksjon i langtidsstudier. Likevel omfattende langsiktig oppfølging og retrospektiv meta-analysen viste at stamcelleterapi gir betydelig fordel for noen pasienter, men ikke i andre med en rekke uforutsigbare utfall ^21. Det er mulig at disse begrensningene vil nødvendiggjøre utformingen av spesifikke protokoller i celle levering for hvert individ, og hver sykdom.

I mus og rottemodeller, langtidsstudier viste at celle injeksjon ikke ytterligere forbedre hjertefunksjon (12 måneder). Faktisk, grafts av humane embryonale stamcelle avledet cardiomyocytes (hESC-CM) ble i stor grad isolert fra verts myocardium av et lag av fibrotisk vev ^22,23. Lignende resultater har blitt observert etter intramyocardial transplantasjon av skjelett myoblasts inn i hjertet av infarkt mus ^24. Furthermore, den langsiktige evne til allogene MSCs å bevare funksjonen i infarkt hjerte har vært begrenset av overgangen fra en immunoprivileged til en immunogent tilstand etter differensiering ^25.

Tatt i betraktning de utfordringene og prospekter som er skissert ovenfor, viser vi her hvordan du kan levere celler ved intramyocardial injeksjon i mus. Vi ser at celler uten cardiomyocyte kontraktile egenskaper ikke er forbundet med verts myokardium og danne en sammenhengende masse med en tynn fibrotisk barriere. Selv om det i noen tilfeller er dette resultatet kan være fordelaktig, kan den følgende analysen være nyttig for å forstå hvordan celle engraftment kan være modulert for å generere funksjonsmessig forbundne myokardielle strukturer også.

Protocol

Alle dyrestudier ble utført i samsvar med internasjonale (Direktiv 2010/63/EU av Europaparlamentet) og nasjonalt (UK Home Office, Act 1986) regelverk. Prosedyrene beskrevet her er en del av vår plan for arbeid under britiske konsesjonsmyndighetene, og har ikke blitt foretatt i den hensikt opptaket. En. Utarbeidelse av celler Denne protokollen beskriver utarbeidelse av en bestemt cellelinje (Human embryonale nyre, HEK293 celler) for demonstrasjonsformål. Cell-spe…

Representative Results

Vi injisert HEK293 celler, som er skjelnes fra hjerteceller ved sin annen morfologi (fig. 1), med en brostein form i forhold til de langstrakte cardiomyocytes (Figur 1a). HEK293 cellene var mer reaktiv til hematoxylin fargestoff (blå farge) i forhold til cardiomyocytes (rosa farge), sannsynligvis på grunn av deres økte kjerneinnhold (figur 1A). For ytterligere å skille de injiserte celler fra vertsvevet, ble HEK293-celler merket med DAPI 2 timer før injeksjon. Merk…

Discussion

I dette manuskriptet, har vi vist hvordan du utfører intramyocardial injeksjon av celler i murine hjerter. Som et bevis på denne metodikken, har vi brukt HEK293 celler. Det er viktig å understreke at HEK293 celler ikke blir brukt i noen celleterapi studie og derfor resultatene av dette manuskriptet er ikke egnet for direkte oversettelse til en terapeutisk tilnærming. Imidlertid, det faktum at HEK293-celler ikke er kontraktile celler og ikke transdifferentiate i andre celletyper retter oppmerksomheten mot tekniske as…

Materials

Isolator	Pfi systems	–	Quotation needed
Heating Pad	Vet Tech Solutions	HE006	For small animals
medetomidine	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
ketamine hydrochloride	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
atipamezole	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
Hair removal cream	Commercial shops	–
buprenorphine	NVS	–	Veterinary prescription is necessary
Leica MZFLIII microscope	Leica	Model S6E	With swing arm stand TS0
Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner	Hamamatsu	RS series
Scanning Electron Microscope	Jeol	JSM-6610
Blunt scissors	FST	14084-09
Minivent	Harvard apparatus	73-0043	Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)
Forceps	FST	11052-10
Retraction system	FST	18200-20	Kit for animals up to 200grams
30G 12mm; ½ inch	BBraun	A210	Fine yellow
microliter syringe	ESSLAB	81201	Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalogue number 83700
6-0 silk suture	Ethicon	W1614T