Слепой кишки Лигирование и прокол, вызванной Сепсис как модель для изучения аутофагии у мышей
Summary
Экспериментальная сепсис могут быть вызваны у мышей с помощью слепой кишки перевязки и пункции метод (CLP). Современные протоколы для оценки аутофагию в естественных условиях в контексте CLP-индуцированного сепсиса представлены здесь: протокол для измерения аутофагию используя (GFP)-lc3 мышей и протокол для измерения образование аутофагосом с помощью электронной микроскопии.
Abstract
Экспериментальная сепсис могут быть вызваны у мышей с помощью слепой кишки перевязки и пункции метод (CLP), что приводит к полимикробная сепсис. Здесь, протокол предоставляется вызвать сепсис различной степени тяжести у мышей с использованием метода CLP. Аутофагия является ответом фундаментальная ткани к стрессу и возбудителя инвазии. Два настоящие протоколы для оценки аутофагию в естественных условиях в контексте экспериментального сепсиса также представлены здесь. (I) Трансгенные мыши, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок (GFP)-LC3 слитого белка подвергают CLP. Локализованный усиление сигнала (GFP Puncta), а анализировали либо иммуногистохимических анализов или конфокальных, могут быть использованы для обнаружения формирование расширенной аутофагосом и, таким образом, изменения активация аутофагии пути. (II) усиление аутофагической вакуоль (аутофагосом) формирование на единицу площади ткани (в качестве маркера аутофагии стимуляции) может быть определена количественно с помощью электронной микроскопии. Изучение аутофагии ответов на сепсиса является одним из важнейших получения оценочногоonent понимания механизмов, посредством которых ткани реагируют на инфекции. Результаты исследований в этой области в конечном итоге может способствовать понимания патогенеза сепсиса, который представляет собой серьезную проблему в реаниматологии.
Introduction
Сепсис, системный воспалительный ответ на инфекцию, представляет собой основной причиной смерти в критически больных пациентов 1. Интраабдоминальной инфекции, часто ведущие к полимикробной сепсиса, составляют 20% от сепсиса случаях, которые имеют существенное смертность до 60% 2. Сепсис-связанная с ними смертность в первую очередь является результатом дисфункции многих органов с последующим органной недостаточности 3,4. Дополнительная расследование патогенного механизма этого заболевания необходимо в срочном порядке содействовать развитию новых и более эффективных методов лечения.
Метод слепой кишки перевязки и пункции (CLP) является широко используемым процедура моделирования сепсиса в естественных условиях. Как слепая кишка полна бактерий, ее результаты пункции в полимикробная перитонита, транслокация бактерий в кровь (бактериемия), септический шок, дисфункция полиорганной и, в конечном счете, смерть 5. Принято считать, что CLP отражает клиническийреальность более точно, чем предыдущие методы, такие как инъекции эндотоксина или даже очищенных бактерий в грызунов, таким образом, CLP считается золотым стандартом (хотя и не без ограничений) 6 для экспериментальной индукции и, следовательно, исследование патогенеза сепсиса. В этой монографии мы описываем протоколы, предназначенные для оценки патогенетические механизмы сепсиса включают ли аутофагию.
Аутофагия, эволюционно консервативными клеточный процесс, облегчает оборот поврежденных белков и органелл типа митохондрий и играет важную роль в оформлении внутриклеточных патогенов, включая бактерии 7,8. Во время аутофагии, цитозольные белки или органеллы поглощенных в двойные мембраной пузырьков, называемых Аутофагосомы, которые впоследствии доставлены в лизосомах деградации 9. Ряд белков были идентифицированы как гомологов млекопитающих генов аутофагии, связанных с (ГПТ),первоначально идентифицирован в дрожжах, регулирующих процесс аутофагии. Превращение микротрубочек связанных белков-1 легкой цепи 3В (LC3B) (гомолог Atg8) от LC3B-I (свободной форме), чтобы LC3B-II (фосфатидилэтаноламина-сопряженных форма) представляет собой важный шаг в аутофагосом образования 9. Аутофагической дисфункция связана со старением и человека заболеваний, включая рак и нейродегенеративные расстройства 10. Кроме того, аутофагии влияет врожденного и адаптивного иммунитета, таких как презентации антигена, развитие лимфоцитов и секрецию цитокинов иммунных клеток 8. Таким образом, кажется разумным, что аутофагии может также играть роль в системной воспалительной реакции на инфекцию (т.е. при сепсисе).
На сегодняшний день несколько методов были описаны для оценки роли аутофагии в повреждение тканей в естественных условиях. Они включают в себя использование зеленого флуоресцентный белок (GFP)-LC3, выражающих мышей и количественную оценку автофагосомы в ткани с помощью электронной микроскопии (эти два метода описаны в монографии). Дополнительные способы включают количественное аутофагической экспрессии белка в гомогенатах тканей, а также анализ аутофагической потока (как описано в другом месте) 11-13. Цель этого обзора является предоставление настоящие протоколы для оценки аутофагию в естественных условиях в контексте экспериментального сепсиса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Основным преимуществом CLP является то, что позволяет исследователям изучить сепсис различных степеней тяжести (то есть от низкой до середины и высокого класса). Тяжесть индуцированного сепсиса зависит от длины слепой кишки лигированного (которых наиболее важным фактором, определ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| GFP-LC3 Transgenic Mice | Riken (Japan) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
| Xylazine | Henry-Schein | 568-0606 | Xylazine HCl Injection Vet |
| Ketamine | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg/ml |
| EtOH | Fisher | A405-20 | Histology Grade |
| EtOH | Fisher | A407-1 | For Sterilizatiion |
| silk surgical sutures 6-0 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
| buprenorphine-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex Ampules |
| paraformaldehyde (37%) solution | JT Baker | S898-09 | |
| xylenes | Fisher | X3P-1GAL | |
| anti-GFP monoclonal antibody | Life Technologies | G10362 | |
| Hoescht | Sigma | 944403 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
| Sudan Black | Santa Cruz | sc-203760 | |
| EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate | Electron microscopy Sciences | 15960 | |
| propylene oxide | Sigma | 240397 | |
| Agar 100 resin | Agar scientific | R1045 | |
| dodecenylsuccinic anhydride | Sigma | 46346 | |
| methylnadic anhydride | Sigma | 45359 | |
| N-benzyldimethylamine | Sigma | 185582 |
References
- Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).
- Anaya, D. A., Nathens, A. B. Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis. Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).
- Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A. Sepsis: A new hypothesis for pathogenesis of the disease process. Chest. 112, 235-243 (1997).
- Rivers, E., Med, s. h. o. c. k. .. N. .. E. n. g. l. .. J. .., et al. Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock. N. Engl. J. Med.. 345, 1368-1377 (2001).
- Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24 (Suppl 1), 19-23 (2005).
- Raven, K. Rodent models of sepsis found shockingly lacking. Nat. Med. 18, 998 (2012).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10, 461-470 (2009).
- Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
- Choi, A. M., Ryter, S. W., Levine, B. Autophagy in human health and disease. N. Engl. J. Med. 368, 651-662 (2013).
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7, 629-642 (2011).
- Chen, Z. H., et al. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLos One. 3, 3313 (2008).
- Kim, H. P., Chen, Z. H., Choi, A. M., Ryter, S. W. Analyzing autophagy in clinical tissues of lung and vascular diseases. Meth. Enzymol. 453, 197-216 (2009).
- Flierl, M. A., et al. Adverse functions of IL-17A in experimental sepsis. FASEB J. 22, 2198-2205 (2008).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nat. Protoc. 4, 31-36 (2009).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
- Wang, L., Ma, R., Flavell, R. A., Choi, M. E. Requirement of mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3) for activation of p38α and p38δ MAPK isoforms by TGF-β1 in murine mesangial cells. J. Biol. Chem. 277, 47257-47262 (2002).
- Ding, Y., Kim, J. K., Kim, S. I., Na, H. J., Jun, S. Y., Lee, S. J., Choi, M. E. TGF-{beta}1 protects against mesangial cell apoptosis via induction of autophagy. J Biol Chem. 285, 37909-37919 (2010).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
- Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J. Surg. Res. 102, 45-49 (2002).
- Carchman, E. H., Rao, J., Loughran, P. A., Rosengart, M. R., Zuckerbraun, B. S. Heme oxygenase-1-mediated autophagy protects against hepatocyte cell death and hepatic injury from infection/sepsis in mice. Hepatology. 53, 2053-2062 (2011).
- Lo, S., et al. Lc3 over-expression improves survival and attenuates lung injury through increasing autophagosomal clearance in septic mice. Ann. Surg. 257, 352-363 (2013).
