Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em> In Vitro</em> E<em> In Vivo</em> Estudar Neuronal Morfologia e Migração
Summary
Morfogênese neuronal ea migração são eventos cruciais subjacentes ao desenvolvimento do cérebro. Aqui, descrevemos os métodos para manipular geneticamente cultivadas neurônios granulares do cerebelo e do cerebelo em desenvolvimento para a avaliação da morfologia e características migratórias dos neurônios.
Abstract
Eventos do desenvolvimento do cérebro, incluindo a morfogênese neuronal ea migração são altamente processos orquestrado. In vitro e in vivo analisa permitir uma caracterização aprofundada para identificar vias envolvidas nestes eventos. Neurónios de grânulos de cerebelo (CGNs) que são derivadas a partir do cerebelo em desenvolvimento, são um sistema modelo ideal, que permite visualizar as alterações morfológicas. Aqui, descrevemos um método de como manipular geneticamente CGNs e como estudar axono e dendritogenesis de neurônios individuais. Com este método, os efeitos de interferência de ARN, ou a sobre-expressão de moléculas pequenas podem ser comparadas para controlar neurónios. Além disso, o córtex cerebelar é um roedor facilmente acessíveis no sistema in vivo, devido ao seu desenvolvimento pós-natal predominante. Apresentamos também uma técnica de eletroporação in vivo para manipular geneticamente o cerebelo desenvolver e descrever cerebelar posterior análise para avaliar a morfologia neuronal umaª migração.
Introduction
O cerebelo é um sistema excelente para estudar mecanismos de crescimento do axônio e migração. O cerebelo tem sido objeto de estudos anatômicos desde o alvorecer da neurociência 1. Microscopia moderna e técnicas de imunohistoquímica têm significativamente ampliado e aperfeiçoado as descobertas iniciais de Santiago, Ramon e Cajal 2-4. Genética do rato e estudos moleculares descobriram fatores de crescimento e de transcrição essenciais no controle do desenvolvimento do cerebelo, o que levou a uma maior compreensão dos acontecimentos cruciais necessários para a ligação adequada dos diferentes tipos de neurônios, incluindo os neurônios granulares do cerebelo (CGNs) 5-7.
O cerebelo é um derivado de rhombomere 1 da parte posterior do cérebro em desenvolvimento 8. O lábio rômbico, que é parte do teto do 4 º ventrículo, dá origem a progenitores grânulo de neurônios do cerebelo, que constituem a população neuronal mais numerosos nocerebelo adulto 9. Após a migração rostral, eles se instalarem no anlage cerebelar. Aqui, a mitose dos precursores de grânulos de neurónios conduz à expansão dramática da camada granular externa (EGL), que tem lugar após o nascimento, em roedores. A partir da EGL, os neurônios começam a migrar para o interior através da camada molecular (ML), passando pela camada de células de Purkinje de tomar em última instância, a residir na camada granular interna (IGL 2). Durante esse processo migratório, eles adquirem uma forma bipolar com dois axônios que se estende para o ML. Após mais de migração, o corpo da célula migra longe dos axônios e os dois processos se fundem para formar um bifurcado, axônio em forma de T 10. Posteriormente, esses axônios fasciculada e são referidas como fibras paralelas. Tendo estabelecido no IGL, CGNs crescer dendritos, que formam garras dendríticas para estabelecer sinapses com fibras musgosas. Para examinar os processos fundamentais no cerebelo em desenvolvimento, um combinado in vitro e in vivo approach permite resultados confiáveis e conclusões.
CGNs não são apenas os mais numerosos neurônios do cerebelo, mas de todo o cérebro e pode ser cultivado ao elevado grau de pureza 11-13. Na cultura, essa população neuronal altamente homogêneo torna-se rapidamente pós-mitótico e adquire uma morfologia polar com axônios e dendritos facilmente identificáveis. CGNs cultivadas têm provado ser extremamente útil para estudar vários aspectos do desenvolvimento neuronal, incluindo a proliferação de células progenitoras, diferenciação, axonal e desenvolvimento dendrito, a migração neuronal, apoptose e propriedades eletrofisiológicas (14-19 e muitos outros). O uso da manipulação genética ampliou a versatilidade de CGNs cultivadas e permitiu uma visão mais mecanicista nos eventos acima mencionados. A transfecção de neurônios cultivados utilizando fosfato de cálcio de baixa eficiência ou métodos lipofílicos seguido por imunocitoquímica com marcadores de polaridade ou apoiados pelo software de análise de facilitarstados a avaliação de, por exemplo a morfologia de neurónios individuais na cultura neuronal densa. Com esta abordagem, o papel de proteínas de interesse em axónio ou dendrito crescimento pode ser estudada 20-25,26-28. Este sistema de cultivo, porém, é menos útil para analisar a migração neuronal como a migração é muito limitado em culturas de alta densidade e exigiria co-culturas. A análise in vitro de axônio e dendritos crescimento também permite a análise de proteínas interligados de uma via de sinalização que utilizam combinações de interferência de RNA (i), a sobre-expressão ou pequenas moléculas.
Para estabelecer a relevância da proteína de interesse em axônio e dendritos regulação do crescimento ou da migração neuronal, a eletroporação in vivo (IVE) técnica permite a análise no córtex cerebelar em desenvolvimento. Devido ao facto de o desenvolvimento do cerebelo em roedores estende caminho para as primeiras duas semanas após o nascimento, o cerebelo representa um accessibestrutura cerebral le para manipulações genéticas para examinar o desenvolvimento de axônios e dendritos, a migração neuronal, sinaptogênese e apoptose 20-24,29,30,26,27,31-34. Além disso, este modelo de sistema também é útil para outros aspectos do desenvolvimento neuronal que exigem o córtex cerebelar intacto como pathfinding axônio, cabeamento e conectividade dos neurônios e interações neurônio-glia em conjunto, este protocolo fornece in vitro e in vivo, para enfrentar uma abordagem complementar sobre morfogênese neuronal e migração.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vantagens e limitações do descrito, in vitro e in vivo em métodos:
CGNs cultivadas de rato e ratos são igualmente adequado para análises morfológicas. Devido ao maior tamanho de cerebelo de rato, o rendimento de CNGs a partir de crias de ratos excede a de filhotes de rato de 3-4x. Além de CGNs, os neurónios corticais e do hipocampo pode ser usado como sistema de cultura, bem. O método de fosfato de cálcio resulta numa baixa (0,01-5%) eficiência de transfecção, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos N. Schwedhelm-Domeyer pela excelente assistência técnica, C. Martelo e S. Papiol ajuda com as análises estatísticas. Nosso trabalho é financiado pela Sociedade Max Planck, o Deutsche Forschungsgemeinschaft, o Centro de Microscopia nanoescala e Fisiologia Molecular do Cérebro (CNMPB), Göttingen, Alemanha e pelo GGNB Júnior Grupo Bolsa da Universidade de Göttingen.
Materials
| DMEM | Gibco | 11960-044 | |
| BME | Gibco | 41010-026 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
| CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
| Isofluorane | Actavis Deutschland | ||
| Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| ECM 830 and tweezertrodes | Harvard Apparatus | ||
| Epifluorescence microscope and camera | Nikon | ||
| SP2 confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| MS Excel | Microsoft | ||
| Loading tip 1-200 µl | Costar | 4853 | |
| Pipette tip 200 µl | Sarstedt | 70.760.502 | |
| Microlance 3 needle, 30 gauge | BD | 302200 | |
| 50 µl gastight Syringe 1705 | Hamilton | ||
| Glass coverslips | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |
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