JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bio-ingénierie

Aplysia Tek Nöronların Elektrofizyolojik ve Moleküler Analizleri için Gangliyon Hazırlama

Published: January 13, 2014
doi:
10.3791/51075
, ,
1Department of Neuroscience,The Scripps Research Institute, Florida

Summary

Deniz salyangozu Aplysia californica, davranışın hücresel ve moleküler temelleri üzerine yapılan çalışmalar için nörobiyoloji modeli olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, tanımlanan sinir devrelerinin tek nöronlarının elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için Aplysia’nın sinir sistemini keşfetmek için bir metodoloji açıklanmaktadır.

Abstract

Nörobiyolojide önemli bir zorluk, belirli bir davranışı yöneten sinir devrelerinin moleküler temellerini anlamaktır. Spesifik moleküler mekanizmalar belirlendikten sonra, dejeneratif hastalıkların veya sinir sisteminin yaşlanmasının neden olduğu belirli davranışlardaki anormallikleri tedavi etmek için yeni terapötik stratejiler geliştirilebilir. Deniz salyangozu Aplysia californica, davranışın hücresel ve moleküler temelinin araştırılması için çok uygundur, çünkü belirli bir davranışın altında kalan sinir devreleri kolayca belirlenebilir ve devrenin bireysel bileşenleri kolayca manipüle edilebilir. Aplysia’nın bu avantajları, öğrenme ve hafıza nörobiyolojisinin birkaç temel keşifine yol açmıştır. Burada, aplysia sinir sisteminin bireysel nöronların elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için bir hazırlığını açıklıyoruz. Kısaca, sinir sisteminden parçalanan ganglion, ganglion kılıfını çıkarmak için proteazlara maruz kalır, böylece nöronlar maruz kalır, ancak bozulmamış hayvanda olduğu gibi nöronal aktiviteyi korur. Bu preparat, tek veya birden fazla nöronun elektrofizyolojik ölçümlerini yapmak için kullanılır. Daha da önemlisi, basit bir metodoloji kullanılarak kaydı takiben, nöronlar gen ekspresyon analizi için doğrudan gangliyondan izole edilebilir. Bu protokoller, L7 ve R15 nöronlarından eşzamanlı elektrofizyolojik kayıtları gerçekleştirmek, aplysia’nınizole tek L7, L11, R15 ve R2 nöronlarında CREB1 geninin asetilkolin ve nicel ekspresyonlarına yanıtlarını incelemek için kullanıldı.

Introduction

İnsan beyni, neredeyse 100 milyar nöron ve trilyonlarca sinaptik bağlantı ile olağanüstü karmaşıktır. Nöronlarla etkileşime giren ve beyindeki işlevlerini düzenleyen neredeyse eşit sayıda nonneuronal hücre vardır. Nöronlar belirli davranışları düzenleyen devreler halinde düzenlenir. Beyin fonksiyonlarını ve sinir devrelerini anlamamızdaki gelişmelere rağmen, belirli bir davranışı kontrol eden devre bileşenlerinin kimliği hakkında çok az şey bilinmektedir. Bir devrenin çeşitli bileşenlerinin kimliklerinin bilgisi, davranışın hem hücresel hem de moleküler temelini anlamamızı büyük ölçüde kolaylaştıracak ve nöropsikiyatrik bozukluklar için yeni terapötik stratejiler geliştirmeye yardımcı olacaktır.

Deniz salyangozu Aplysia californica, belirli davranışların altında kalan nöronal devreleri belirlemek için bir çalışma atı olmuştur1-14. Aplysia sinir sistemi, 9 farklı gangliyon halinde organize edilmiş yaklaşık 20.000 nöron içerir. Aplysia’nın nöronları büyüktür ve boyutlarına, elektriksel özelliklerine ve gangliyondaki konumlarına göre kolayca tanımlanabilir. Aplysia, çalışılabilen zengin bir davranış repertuarına sahiptir. İyi çalışılmış davranışlardan biri solungaç çekme refleksidir (GWR). Bu refleksin merkezi bileşenleri abdominal gangliyonlarda bulunur. GWR devresinin bileşenleri haritalandı ve çeşitli bileşenlerin katkıları belirlendi. Daha da önemlisi, GWR devresi ilişkilendirilebilir ve ilişkisiz öğrenmeden geçer5,6,15-19. Bu refleks üzerinde onlarca yıllık çalışma da öğrenme ve hafızada kilit bir role sahip birkaç sinyal yolu tanımlamıştır20-24.

Hafıza depolamanın hücresel ve moleküler temelini incelemek için Aplysia’nın birkaç farklı preparatı kullanıldı. Bunlar arasında sağlam hayvan2,3, yarı bozulmamış hazırlık1,7,13,14,16 ve nöral devrenin ana bileşenlerinin yeniden25-29. Tanımlanan nöronal devrelerin elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için Aplysia gangliyonlarını keşfetmeye yönelik daha az hazırlık burada açıklanmıştır. Tespit edilen dört nöron incelendi. R15, patlayan bir nöron, L7 ve L11, iki farklı motor nöron ve bir kolinerjik nöron olan R2 incelendi. R2 omurgasız sinir sisteminde tanımlanan en büyük nörondur. Kısaca, bu metodoloji gangliyonların proteaz tedavisini, farmakolojik tedavilerden önce ve sonra elektrofizyolojik ölçümleri ve gen ekspresyonunun nicel analizi için tek nöronların izolasyonu içerir. Bu metodoloji, moleküler analizleri birden fazla nörondan eşzamanlı kayıtla birleştirmemizi sağlar. Bu metodoloji, R15 ve L7 nöronlarının asetilkoline (Ach) eşleştirilmiş hücre içi kayıtlarla verdiği yanıtları incelemek için başarıyla kullanılmıştır. Elektrofizyolojik ölçümler sonrasında R15 ve L7 ve L11 ve R2 gibi tanımlanan diğer nöronlar, bellek depolama için önemli bir transkripsiyon faktörü olan CREB1 ekspresyonunun nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizi için izole edildi.

Protocol

1. Abdominal Ganglion Aplysia californica Abdominal Ganglion’dan Abdominal Ganglionların Hazırlanması, Elektrofizyolojik Ölçümler ve Tek Tanımlanmış Nöronların İzolasyonu Aplysia’yı laboratuvar akvaryumunda 12:12 ışık:karanlık koşullar altında 16 °C’de dolaşan yapay deniz suyu (ASW) ile koruyun. Karın ganglionunun izolasyonu. 5-10 dakika boyunca 380 mM MgCl2 çözeltisi enjekte ederek hayvanları uyuşturun (hayvanın vücut ağırlığının%…

Representative Results

Bu çalışmada kullanılan hayvanların ağırlıkları 100-200 g arasında değişmektedir. Açıklanan protokollerin ardından 2-5 g ile 200-300 g arasında değişen hayvanlardan izole edilmiş abdominal gangliyon nöronlarının elektrofizyolojik ölçümlerini ve moleküler analizlerini yaptık. Proteaz tedavisinin standardizasyonu, gangliyonlardaki nöronların başarılı elektrofizyolojik ölçümleri için önemlidir. Başlangıçta, birden fazla proteaz (Dispase) konsantrasyonu ve s…

Discussion

Nöron R15 kardiyovasküler, sindirim, solunum ve üreme sistemlerinin düzenlenmesinde rol oynar30. AP’nin düzenli olarak ritmik bir patlama aktivitesi R15’in bir özelliğidir. Sonuçlar bölümünde gösterildiği gibi, R15 ve L7’nin eşleştirilmiş kaydı, gangliyon preparatının R15 nöronlarının aktivitesini koruduğunu göstermektedir. R15 ve L7 nöronları Ach’e uygun şekilde yanıt verdi. Bu gangliyon preparat 8-10 saate kadar sürdürülebilir ve elektrofizyolojik aktivite sürekli olarak izlen…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Whitehall Vakfı’na, scripps araştırma enstitüsünden bu çalışmayı yürüttükleri için fon desteği ve başlangıç fonları için içtenlikle teşekkür ederiz.

Materials

Aplysia National Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaCl SIGMA S 3014-1KG
KCl SIGMA P 9333-500G
CaCl2•2H2O SIGMA C5080- 500G
MgCl2•6H2O Fisher Scientific BP 214-501
NaHCO4 SIGMA S 6297-250G
HEPES SIGMA H 3375-500G
Protease GIBCO 17105-042
Trizol Ambion 15596-026
Chloroform MP Biomedicals 2194002
100% Ethanol ACROS 64-17-5
GlycoBlue Ambion AM9515
3 M NaOAc, pH 5.5 Ambion AM9740
Nuclease free water Ambion AM9737
MessageAmp II aRNA Amplification Kit Ambion AM1751
qScript cDNA SuperMix Quanta Biosciences 95048-100
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4367659
Forceps Fine Science Tools 11252-20
Scissors Fine Science Tools 15000-08
Stainless Steel Minutien Pins  Fine Science Tools 26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler
5430R Centrifuge Eppendorf 5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCR Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR
Amplifier BRAMP-01R NPI Electronics
Digidata Converter Instrutech ITC-18 HEKA ELEKTRONIK
Micro Manipulator Patch Star Scientifica
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cleary, L. J., Byrne, J. H., Frost, W. N. Role of interneurons in defensive withdrawal reflexes in Aplysia. Learn. Mem. 2, 133-151 (1995).
  2. Elliott, C. J., Susswein, A. J. Comparative neuroethology of feeding control in molluscs. The J. Exp. Biol. 205, 877-896 (2002).
  3. Nargeot, R., Simmers, J. Functional organization and adaptability of a decision-making network in Aplysia. Front. Neurosci. 6, 113 (2012).
  4. Baxter, D. A., Byrne, J. H. Feeding behavior of Aplysia: a model system for comparing cellular mechanisms of classical and operant conditioning. Learn. Mem. 13, 669-680 (2006).
  5. Castellucci, V., Pinsker, H., Kupfermann, I., Kandel, E. R. Neuronal mechanisms of habituation and dishabituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167, 1745-1748 (1970).
  6. Castellucci, V. F., Carew, T. J., Kandel, E. R. Cellular analysis of long-term habituation of the gill-withdrawal reflex of Aplysia californica. Science. 202, 1306-1308 (1978).
  7. Dembrow, N. C., et al. A newly identified buccal interneuron initiates and modulates feeding motor programs in Aplysia. J. Neurophysiol. 90, 2190-2204 (2003).
  8. Fredman, S. M., Jahan-Parwar, B. Command neurons for locomotion in Aplysia. J. Neurophysiol. 49, 1092-1117 (1983).
  9. Jing, J., Vilim, F. S., Cropper, E. C., Weiss, K. R. Neural analog of arousal: persistent conditional activation of a feeding modulator by serotonergic initiators of locomotion. J. Neurosci. 28, 12349-12361 (2008).
  10. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An in vitro preparation for eliciting and recording feeding motor programs with physiological movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (4320), (2012).
  11. McPherson, D. R., Blankenship, J. E. Neuronal modulation of foot and body-wall contractions in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 67, 23-28 (1992).
  12. Miller, N., Saada, R., Fishman, S., Hurwitz, I., Susswein, A. J. Neurons controlling Aplysia feeding inhibit themselves by continuous NO production. PloS one. 6, (2011).
  13. Perrins, R., Weiss, K. R. A cerebral central pattern generator in Aplysia and its connections with buccal feeding circuitry. J. Neurosci. 16, 7030-7045 (1996).
  14. Xin, Y., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified interneuron contributes to aspects of six different behaviors in Aplysia. J. Neurosci. 16, 5266-5279 (1996).
  15. Carew, T. J., Castellucci, V. F., Byrne, J. H., Kandel, E. R. Quantitative analysis of relative contribution of central and peripheral neurons to gill-withdrawal reflex in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 42, 497-509 (1979).
  16. Cohen, T. E., Kaplan, S. W., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: mechanisms contributing to habituation, dishabituation, and sensitization of the Aplysia gill-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2886-2899 (1997).
  17. Frost, L., et al. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: contribution of LE and unidentified siphon sensory neurons to mediation and habituation of the Aplysia gill- and siphon-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2900-2913 (1997).
  18. Frost, W. N., Castellucci, V. F., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Monosynaptic connections made by the sensory neurons of the gill- and siphon-withdrawal reflex in Aplysia participate in the storage of long-term memory for sensitization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8266-8269 (1985).
  19. Hawkins, R. D., Greene, W., Kandel, E. R. Classical conditioning, differential conditioning, and second-order conditioning of the Aplysia gill-withdrawal reflex in a simplified mantle organ preparation. Behav. Neurosci. 112, 636-645 (1998).
  20. Hawkins, R. D., Clark, G. A., Kandel, E. R. Operant conditioning of gill withdrawal in Aplysia. J. Neurosci. 26, 2443-2448 (2006).
  21. Cai, D., Chen, S., Glanzman, D. L. Postsynaptic regulation of long-term facilitation in Aplysia. Curr. Biol. 18, 920-925 (2008).
  22. Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
  23. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294, 1030-1038 (2001).
  24. Wan, Q., Abrams, T. W. Trans-synaptic plasticity: presynaptic initiation, postsynaptic memory. Curr. Biol. 18, 220-223 (2008).
  25. Bao, J. X., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Involvement of presynaptic and postsynaptic mechanisms in a cellular analog of classical conditioning at Aplysia sensory-motor neuron synapses in isolated cell culture. J. Neurosci. 18, 458-466 (1998).
  26. Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Classical conditioning analog enhanced acetylcholine responses but reduced excitability of an identified neuron. J. Neurosci. 31, 14789-14793 (2011).
  27. Martin, K. C., et al. Synapse-Specific, Long-Term Facilitation of Aplysia Sensory to Motor Synapses: A Function for Local Protein Synthesis in Memory Storage. Cell. 91, 927-938 (1997).
  28. Montarolo, P. G., et al. A critical period for macromolecular synthesis in long-term heterosynaptic facilitation in Aplysia. Science. 234, 1249-1254 (1986).
  29. Mozzachiodi, R., Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Changes in neuronal excitability serve as a mechanism of long-term memory for operant conditioning. Nat. Neurosci. 11, 1146-1148 (2008).
  30. Alevizos, A., Weiss, K. R., Koester, J. Synaptic actions of identified peptidergic neuron R15 in Aplysia. I. Activation of respiratory pumping. J. Neurosci. 11, 1263-1274 (1991).
  31. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome. Res. 6, 986-994 (1996).
  32. Moroz, L. L., et al. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
  33. Moroz, L. L., Kohn, A. B. Do different neurons age differently? Direct genome-wide analysis of aging in single identified cholinergic neurons. Front. Aging Neurosci. 2, (2010).
  34. Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Genomics and proteomics in solving brain complexity. Mol. BioSyst. , (2013).
  35. Clemens, S., Katz, P. S. Identified serotonergic neurons in the Tritonia swim CPG activate both ionotropic and metabotropic receptors. J. Neurophysiol. 85, 476-479 (2001).
  36. Murray, J. A., Hewes, R. S., Willows, A. O. Water-flow sensitive pedal neurons in Tritonia: role in rheotaxis. J. Comp. Physiol. 171, 373-385 (1992).
  37. Katz, P. S., Frost, W. N. Intrinsic neuromodulation in the Tritonia swim CPG: the serotonergic dorsal swim interneurons act presynaptically to enhance transmitter release from interneuron C2. J. Neurosci. 15, 6035-6045 (1995).
  38. Brown, G. D., Frost, W. N., Getting, P. A. Habituation and iterative enhancement of multiple components of the Tritonia swim response. Behav. Neurosci. 110, 478-485 (1996).
  39. Popescu, I. R., Frost, W. N. Highly dissimilar behaviors mediated by a multifunctional network in the marine mollusk Tritonia diomedea. J. Neurosci. 22, 1985-1993 (2002).
  40. Megalou, E. V., Brandon, C. J., Frost, W. N. Evidence that the swim afferent neurons of tritonia diomedea are glutamatergic. Biol. Bull. 216, 103-112 (2009).
  41. Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PloS one. 7, (2012).
  42. Yeoman, M. S., Patel, B. A., Arundell, M., Parker, K., O’Hare, D. Synapse-specific changes in serotonin signalling contribute to age-related changes in the feeding behaviour of the pond snail. Lymnaea. J. Neurochem. 106, 1699-1709 (2008).
  43. Moroz, L. L., Dahlgren, R. L., Boudko, D., Sweedler, J. V., Lovell, P. Direct single cell determination of nitric oxide synthase related metabolites in identified nitrergic neurons. J. Inorg. Biochem. 99, 929-939 (2005).
  44. Alania, M., Sakharov, D. A., Elliott, C. J. Multilevel inhibition of feeding by a peptidergic pleural interneuron in the mollusc Lymnaea stagnalis. J. Comp. Physiol. 190, 379-390 (2004).
  45. Straub, V. A., Benjamin, P. R. Extrinsic modulation and motor pattern generation in a feeding network: a cellular study. J. Neurosci. 21, 1767-1778 (2001).
  46. Vehovszky, A., Elliott, C. J. The octopamine-containing buccal neurons are a new group of feeding interneurons in the pond snail Lymnaea stagnalis. Acta Biol. Hungarica. 51, 165-176 (2000).
  47. Jansen, R. F., Pieneman, A. W., ter Maat, A. Spontaneous switching between ortho- and antidromic spiking as the normal mode of firing in the cerebral giant neurons of freely behaving Lymnaea stagnalis. J. Neurophysiol. 76, 4206-4209 (1996).
  48. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  49. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Buccal neurons activate ciliary beating in the foregut of the pteropod mollusk Clione limacina. J. Exp. Biol. 212, 2969-2976 (2009).
  50. Ierusalimsky, V. N., Balaban, P. M. Primary sensory neurons containing command neuron peptide constitute a morphologically distinct class of sensory neurons in the terrestrial snail. Cell Tissue Res. 330, 169-177 (2007).
  51. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Identification of mechanoafferent neurons in terrestrial snail: response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 87, 2364-2371 (2002).
  52. Balaban, P. M., et al. A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol. Learn. Mem. 75, 30-50 (2001).
  53. Ierusalimsky, V. N., Zakharov, I. S., Palikhova, T. A., Balaban, P. M. Nervous system and neural maps in gastropod Helix lucorum. 24, 13-22 (1994).
  54. Kharchenko, O. A., Grinkevich, V. V., Vorobiova, O. V., Grinkevich, L. N. Learning-induced lateralized activation of the MAPK/ERK cascade in identified neurons of the food-aversion network in the mollusk Helix lucorum. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 158-166 (2010).
  55. Ivanova, J. L., et al. Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cell. Mol. Neurobiol.. 26, 127-144 (2006).
  56. Kiss, T. Evidence for a persistent Na-conductance in identified command neurones of the snail, Helix pomatia. Brain Res. 989, 16-25 (2003).
  57. Balaban, P. M. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci. Biobehav. Rev. 26, 597-630 (2002).

Tags

Keywords: Aplysia GangliaElectrophysiologyMolecular AnalysisSingle NeuronNeural CircuitrySciences du comportementProteaseGene ExpressionCREB1L7R15L11R2
check_url/fr/51075?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons. J. Vis. Exp. (83), e51075, doi:10.3791/51075 (2014).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image