عينة تصحيح الانجراف بعد 4D متحد البؤر التصوير الوقت الفاصل
Summary
الوقت الفاصل بين المجهري يسمح التصور من العمليات التنموية. النمو أو الانجراف العينات خلال الحصول على الصور يقلل من القدرة على متابعة بدقة وقياس الحركات الخلية أثناء التطور. وصفنا استخدام المصدر المفتوح برامج معالجة الصور لتصحيح العينة لمدة ثلاثة الأبعاد الانجراف مع مرور الوقت.
Abstract
توليد رباعي الأبعاد (4D) مجموعات البيانات متحد البؤر؛ تتألف من تسلسلات الصور 3D مع مرور الوقت؛ يوفر منهجية ممتازة لالتقاط السلوكيات الخلوية المشاركة في العمليات التنموية. القدرة على تتبع ومتابعة تحركات الخلية محدودة بسبب الحركات العينة التي تحدث بسبب الانجراف من العينة، أو في بعض الحالات، والنمو خلال الحصول على الصور. وسوف تتبع الخلايا في مجموعات البيانات تتأثر الانجراف و / أو النمو إدماج هذه الحركات في أي تحليل للموقف الخلية. وهذا قد يؤدي في الحركة واضح من هياكل ثابتة ضمن العينة. لذا قبل خلية تتبع، وينبغي تصحيح أي عينة الانجراف. استخدام المصدر المفتوح فيجي توزيع 1 من يماغيج 2،3 والأدوات الامكنه أدرجت 4، قمنا بتطوير 3D الانجراف في المكونات الصحيحة لإزالة الحركة عينة الخاطئة في مجموعات البيانات متحد البؤر. هذا البروتوكول يعوض فعال للترجمة عينة أو تغييرات في بو التنسيقsition من خلال الاستفادة من مرحلة الارتباط لتسجيل كل نقطة مرة من مجموعات البيانات متحد البؤر رباعي الأبعاد مع الحفاظ على القدرة على تصور وقياس الحركات الخلية على تمديد التجارب مرور الزمن.
Introduction
ويستخدم على نطاق واسع التصوير متحد البؤر في الخلية والبيولوجيا التطورية لمتابعة تحركات الخلية والتغييرات في مورفولوجية. يسمح التقاط سلسلة من المقاطع البصرية في طائرات التنسيق المختلفة توليد ثلاثي الأبعاد (3D) نموذج لعينة، ومن ثم يمكن تمديدها إلى أربعة أبعاد (4D) عن طريق إنشاء سلسلة الوقت الفاصل بين مجموعات البيانات 3D. توليد مجموعات البيانات 4D يسمح قياس مفصلة لتحركات الخلية والسلوكيات. في المدى الطويل التجارب مرور الزمن فمن الشائع لمراقبة حركة العينة. يمكن أن يكون سبب ذلك عن طريق أخطاء طفيفة في الأجهزة السيطرة على خشبة المسرح والمواقف المحورية. بينما في حالات أخرى، والانحراف هو نتيجة لحركات الناجم عن النمو عينة أو المرونة في وسائل الاعلام عينة في تصاعد مستمر. توجد طرق للتعويض أو الحد من هذه الحركات بما في ذلك إدخال تحسينات على أنظمة تركز الأجهزة وزيادة صلابة من المتوسطة المتزايدة. ومع ذلك، هذه الأساليب لا يمكن أن تطبق في كثير من الحالات نظرا ليالي التصويرآخرون حتى اللازمة لتوفير الظروف المناسبة لصيانة العينات والنمو. حلول البرمجيات مفتوحة المصدر موجودة لتصحيح الحركة في 2D مع مرور الوقت، من خلال استخدام StackReg وTurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 الإضافات في ImageJ أو فيجي، ولكن هذه لا يمكن يمكن تطبيقها على مجموعات البيانات 4D.
لتصحيح العينة الانجراف وضعنا في قابس (تصحيح الانحراف 3D) للاستفادة من المصدر المفتوح لتجهيز منصة التصوير، فيجي 1. لدينا المكونات هي قادرة على أداء تسجيل ارتباط مرحلة لتصحيح الحركة التي تحدث نتيجة الانجراف العينة في ثلاث تجارب الأبعاد الوقت الفاصل. المرحلة ارتباط 6 هو طريقة فعالة الحسابية لتحديد الترجمة بين الصور. المكونات في وصفها هنا يستخدم المكتبة مرحلة الارتباط التي وضعتها Preibisch وآخرون. 7. في تجارب متعددة القنوات، والمكونات في قناة واحدة تستخدم لمحدداتشمال شرق التصحيح المطلوب. ثم يتم تطبيق هذا التصحيح على أي قنوات إضافية مما أدى إلى تسجيل بيانات 4D.
في النظام النموذجي الزرد فمن الممكن لتنفيذ الوقت الفاصل بين التصوير على مدى عدة ساعات، أو حتى عدة أيام 8. وهناك طريقة مشتركة لتركيب الزرد هو تضمين الجنين يعيش مخدرة في انخفاض الاغاروز نقطة انصهار (0.8-1.5٪)، وتقييد حركتها 9-11. في حين يقتصر حركة النمو من العينة لا يزال يحدث، مما أدى إلى الخلايا داخل مجال الرؤية يتحول الموقف. من أجل متابعة حركة الخلايا داخل الجنين فمن الضروري لتصحيح الأول للحركة من العينة بأكملها. وقد تم تطوير هذا البروتوكول مع العينات الزرد، وقد استخدمت لتطوير صورة الجسيدة 12 ولكن يمكن تطبيقها على أي متحد البؤر بيانات 4D.
Protocol
Representative Results
Discussion
لدينا القدرة على استخدام البرمجيات مرحلة ما بعد المعالجة لتصحيح الانحراف عينة من مجموعات البيانات المستمدة من تمديد الوقت الفاصل بين التجارب المجهري مقيد من خلال عدد من العوامل. القدرة على التمييز الانجراف مقابل حركة الهجرة من عينة يعتمد على علامات الخلوية المستخد…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر غابي مارتينز ومنظمي ورشة العمل التنموي EMBO2010 3D التصوير حيث بدأ هذا العمل وجميع المساهمين في المشاريع فيجي ويماغيج.
Materials
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO |
| Disposable 3mL graduated | Samco | 212 |
| Polyethylene transfer pipette | ||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | |
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).
- Collins, T. J. ImageJ for Microscopy. BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Kuglin, C. D., Hines, D. C. The phase correlation image alignment method. Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos. J VIs. Exp. (36), (2010).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).
- Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).
- Nguyen-Chi, M. E., et al. Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome. PLoS Genetics. 8 (10), (2012).
- Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion. Development. 134 (17), 3145-3153 (2007).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Biologie du développement. 192 (2), 289-299 (1997).
