4D Confocal इमेजिंग समय चूक निम्न नमूना बहाव सुधार
Summary
समय चूक माइक्रोस्कोपी विकास की प्रक्रिया की अनुमति देता है. छवि अधिग्रहण के दौरान विकास या नमूनों का बहाव सही पालन और विकास के दौरान सेल आंदोलनों को मापने की क्षमता कम कर देता है. हम समय के साथ तीन आयामी नमूना बहाव के लिए सही करने के लिए खुला स्रोत इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के उपयोग का वर्णन.
Abstract
चार आयामी (4D) confocal डेटासेट की पीढ़ी; समय के साथ 3 डी छवि दृश्यों से मिलकर; विकास की प्रक्रिया में शामिल सेलुलर व्यवहार पर कब्जा करने के लिए एक उत्कृष्ट कार्यप्रणाली प्रदान करता है. सेल गतिविधियों पर नज़र रखने और पालन करने की क्षमता छवि अधिग्रहण के दौरान नमूने के बहाव या, कुछ मामलों में, विकास की वजह से होती है कि नमूना आंदोलनों के द्वारा सीमित है. बहाव और / या विकास से प्रभावित डेटासेट में ट्रैकिंग कोशिकाओं सेल की स्थिति के किसी भी विश्लेषण में इन आंदोलनों को शामिल करेंगे. इस नमूने के भीतर स्थिर संरचनाओं के स्पष्ट आंदोलन में हो सकता है. इसलिए पूर्व सेल ट्रैकिंग करने के लिए, किसी भी नमूने बहाव सही किया जाना चाहिए. ImageJ 2,3 के खुले स्रोत फिजी वितरण 1 और शामिल loci उपकरण 4 का उपयोग कर, हम confocal डेटासेट में गलत नमूना आंदोलन को दूर करने के लिए सही 3 डी बहाव प्लग में विकसित किया है. इस प्रोटोकॉल को प्रभावी ढंग से फोकल पुलिस में नमूना अनुवाद या परिवर्तन के लिए क्षतिपूर्तिविस्तारित समय चूक प्रयोगों से अधिक सेल आंदोलनों कल्पना और उपाय करने की क्षमता को बनाए रखते हुए एक चार आयामी confocal डेटासेट का प्रत्येक समय बिंदु रजिस्टर करने के लिए चरण सहसंबंध का उपयोग करके विपक्षी.
Introduction
Confocal इमेजिंग व्यापक रूप आकारिकी में सेल आंदोलनों और परिवर्तनों का पालन करने के लिए सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान में प्रयोग किया जाता है. विभिन्न फोकल विमानों पर ऑप्टिकल वर्गों की एक श्रृंखला पर कब्जा करने की अनुमति देता है तो 3 डी डेटासेट का एक समय चूक श्रृंखला बनाकर चार आयाम (4D) में बढ़ाया जा सकता है जो एक नमूना के एक तीन आयामी (3 डी) मॉडल, की पीढ़ी. 4D डेटासेट की पीढ़ी सेल आंदोलनों और व्यवहार की विस्तृत माप की अनुमति देता है. लंबी अवधि के समय चूक प्रयोगों में यह नमूना आंदोलन का निरीक्षण करने के लिए आम है. इस हार्डवेयर को नियंत्रित करने के चरण में है और केंद्र की स्थिति में मामूली अशुद्धियों के कारण हो सकता है. दूसरों के मामलों में, बहाव नमूना बढ़ते मीडिया के भीतर नमूना विकास या लचीलापन द्वारा प्रेरित आंदोलनों का एक परिणाम है. तरीके हार्डवेयर ध्यान केंद्रित सिस्टम में सुधार और बढ़ते मध्यम की वृद्धि की कठोरता सहित इन आंदोलनों क्षतिपूर्ति या सीमित करने के लिए मौजूद हैं. हालांकि, इन तरीकों के कारण इमेजिंग के लिए कई मामलों में लागू नहीं किया जा सकता हैएट ऊपर नमूने रखरखाव और विकास के लिए उपयुक्त स्थितियां प्रदान करने की आवश्यकता है. ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर समाधान ImageJ या फिजी में StackReg और TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 plugins के उपयोग के माध्यम से, समय के साथ 2 डी में आंदोलन के सुधार के लिए मौजूद है, लेकिन इन नहीं कर सकते 4D डेटासेट के लिए लागू किया.
नमूना बहाव के लिए सही करने के लिए हम खुले स्रोत इमेजिंग प्रसंस्करण मंच, फिजी 1 उपयोग करने के लिए एक प्लग में (सही 3 डी बहाव) विकसित किया है. हमारे प्लग में तीन आयामी समय चूक प्रयोगों में नमूना बहाव का एक परिणाम के रूप में होता है कि आंदोलन को सही करने के चरण सहसंबंध पंजीकरण प्रदर्शन करने में सक्षम है. चरण सहसंबंध 6 छवियों के बीच अनुवाद निर्धारित करने के लिए एक कम्प्यूटेशनल कारगर तरीका है. यहाँ वर्णित प्लग में Preibisch एट अल. 7 द्वारा विकसित चरण सहसंबंध पुस्तकालय का इस्तेमाल करता. मल्टी चैनल प्रयोगों में, प्लग में determi के लिए एक चैनल का इस्तेमालअपेक्षित सुधार NE. यह सुधार तो 4D डाटासेट के पंजीकरण में जिसके परिणामस्वरूप किसी भी अतिरिक्त चैनलों के लिए आवेदन किया है.
Zebrafish मॉडल प्रणाली में यह कई घंटे, या यहाँ तक कि कई दिन 8 की अवधि में समय चूक इमेजिंग बाहर ले जाने के लिए संभव है. Zebrafish बढ़ते के लिए एक आम तरीका अपने आंदोलन 9-11 सीमित है, कम पिघलने बिंदु agarose (0.8-1.5%) में anaesthetized लाइव भ्रूण एम्बेड करने के लिए है. आंदोलन सीमित है जबकि नमूना का विकास अभी भी स्थिति बदलता देखने के क्षेत्र के भीतर कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप होता है. भ्रूण के भीतर कोशिकाओं के आंदोलन का पालन करने के लिए आदेश में यह पहली बार पूरे नमूना के आंदोलन के लिए सही करने के लिए आवश्यक है. इस प्रोटोकॉल zebrafish नमूनों के साथ विकसित किया गया था, और छवि विखंड विकास 12 का उपयोग किया गया है, लेकिन किसी भी 4D confocal डाटासेट करने के लिए लागू किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
विस्तारित समय चूक माइक्रोस्कोपी प्रयोगों से व्युत्पन्न डेटासेट का नमूना बहाव को दूर करने के बाद प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए हमारी क्षमता कारकों की एक संख्या से प्रतिबंधित है. एक नमूना ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम भोला आदमी मार्टिंस और यह काम शुरू किया और फिजी और ImageJ परियोजनाओं के लिए योगदानकर्ताओं के सभी जहां EMBO2010 3D विकास इमेजिंग कार्यशाला के आयोजकों को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO |
| Disposable 3mL graduated | Samco | 212 |
| Polyethylene transfer pipette | ||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | |
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
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