4D共焦点タイムラプスイメージングを、次のサンプルのドリフト補正
Summary
タイムラプス顕微鏡は、発生過程の可視化を可能にする。画像取得中に成長または試料のドリフトが正確に従うと開発中の細胞の動きを測定する能力を低下させる。我々は、時間をかけて、三次元試料ドリフトを補正するためのオープンソースの画像処理ソフトウェアの使用を記載している。
Abstract
4次元（4D）、共焦点データセットの生成;時間をかけて3D画像配列からなる;発生過程に関与する細胞の挙動をキャプチャするための優れた方法論を提供します。細胞の動きを追跡し、追跡する能力は、画像取得時に試料又は、場合によっては、成長中に発生するドリフトによる試料の移動によって制限される。ドリフトおよび/または増殖の影響を受けたデータセットで追跡する細胞は、細胞の位置の任意の分析にこれらの動きを組み込む。これは、サンプル内の静的な構造の見かけの動きになることがあります。そのため前細胞追跡するには、任意のサンプルドリフトを修正する必要があります。 ImageJの2,3のオープンソースフィジー分布1と組み込まれた遺伝子座のツール4を使用して、我々は、共焦点データセットに誤ったサンプルの動きを削除するために正しい3Dドリフトプラグインを開発しました。このプロトコルは、効果的に焦点POのサンプル翻訳や変更を補正長時間経過実験にわたって細胞の動きを視覚化し、測定する能力を維持しながら、四次元共焦点データセットの各時点を登録するために、位相相関を利用してsition。
Introduction
共焦点イメージングは広く形態の細胞の動きや変化に追従するために、細胞および発生生物学で使用されています。異なる焦点面で光一連のセクションをキャプチャすることができ、次いで、3Dデータセットの経時系列を作成することにより、四次元（4D）に拡張することができ、試料の3次元（3D）モデルを生成する。 4Dデータセットの生成は細胞の動きや行動の詳細な測定を可能にします。長期経時実験では、試料の動きを観察することが一般的である。これは、ハードウェア制御の段階と焦点位置のわずかな不正確によって引き起こされる場合があります。他の例では、ドリフトは、サンプルの取り付けメディア内のサンプルの伸びや柔軟性によって誘発される運動の結果ですが。方法はシステムを中心に、ハードウェアの改善を含め、これらの動きを補正するか、制限するために存在し、封入剤の剛性を増加させた。しかしながら、これらのアプローチは、撮像sに多くの場合には適用できないらアップサンプルの維持および増殖に適した条件を提供するために必要。オープンソースのソフトウェア·ソリューションは、ImageJのか、フィジーでSTACKREGとTurboReg（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）5プラグインを使用することで、時間をかけて、2次元の動きを補正するために存在しないが、これらはできない4Dデータセットに適用される。
サンプルドリフトを補正するために、我々はオープンソースの画像処理プラットフォーム、フィジー1を利用するプラグイン（正しい3Dドリフト）を開発した。我々のプラグインは、三次元の時間経過実験において、試料ドリフトの結果として生じる動きを補正する位相相関の登録を行うことができる。位相相関6は、画像間の変換を決定するための計算上効率的な方法である。プラグインは、ここで説明するには、Preibisch らが開発した位相相関ライブラリを利用しています。7。マルチチャンネル実験において、プラグインはdetermiに一つのチャンネルを利用する必要な補正ね。この補正は、次いで、4Dデータセットの登録をもたらす任意の追加のチャネルに適用される。
ゼブラフィッシュモデル系において、多くの時間、あるいは数日の期間にわたって8タイムラプス撮影を行うことができる。ゼブラフィッシュを取り付けるための一般的な方法は、その動きを規制9-11、低融点アガロース（0.8から1.5パーセント）で麻酔し、ライブ胚を埋め込 むことである。移動が規制されながら、試料の成長が依然として位置をずらす視野内の細胞を生じ、発生した。胚内の細胞の移動に追従するためには、まず、試料全体の動きを補正することが必要である。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの標本で現像し、画像12体節の開発に利用されているが、任意の共焦点4Dデータセットに適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
拡張タイムラプス顕微鏡実験に由来するデータセットのサンプルのドリフトを補正するために後処理ソフトウェアを使用する我々の能力は、多くの要因によって制限される。サンプルの渡り鳥の移動に対するドリフトを識別する能力は、使用される細胞マーカーに依存している。どちら広くサンプル内で発現しているか、画像取得中回遊イベントに関与していない細胞マーカーは、ドリフト?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ギャビー·マルティンスと、この作品が始まったとフィジーとImageJのプロジェクトへの貢献者のすべてEMBO2010 3D発達イメージングワークショップの主催者に感謝したいと思います。
Materials
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO |
| Disposable 3mL graduated | Samco | 212 |
| Polyethylene transfer pipette | ||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | |
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
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