Séparation automatique des C. elegans Façon variable colonisé par une bactérie pathogène

Summary

Le wormsorter facilite écrans génétiques dans Caenorhabditis elegans par tri vers selon l'expression de journalistes fluorescentes. Ici, nous décrivons un nouvel usage: le tri selon la colonisation par un agent pathogène exprimant la GFP, et nous l'employons pour examiner le rôle mal compris de la reconnaissance de l'agent pathogène dans l'initiation des réponses immunitaires.

Abstract

Le wormsorter est un instrument analogue à une machine FACS qui est utilisé dans les études de Caenorhabditis elegans, typiquement pour trier vers basés sur l'expression d'un rapporteur fluorescent. Ici, nous mettons en évidence une utilisation alternative de cet instrument, pour trier vers en fonction de leur degré de colonisation par un agent pathogène exprimant la GFP. Cette nouvelle utilisation nous a permis d'aborder la relation entre la colonisation de l'intestin du ver et de l'induction de réponses immunitaires. Alors que C. réponses immunitaires elegans à différents agents pathogènes ont été documentés, il est encore inconnue ce qui les déclenche. Les deux possibilités (qui ne sont pas mutuellement exclusives) sont la reconnaissance de motifs moléculaires associés à des pathogènes et la détection des dommages causés par une infection. Pour différencier entre les deux possibilités, l'exposition à l'agent pathogène doit être dissociée de la dommages qu'il cause. La séparation de wormsorter permis de vers qui ont été largement colonisée par le Gram-npathogène egative Pseudomonas aeruginosa, avec les dommages susceptibles provoquée par la charge pathogène, des vers qui ont été exposées de façon similaire, mais pas, ou peu, colonisé. Ces populations distinctes ont été utilisés pour évaluer la relation entre la charge de l'agent pathogène et l'induction de réponses immunitaires de transcription. Les résultats suggèrent que les deux sont dissociées, confirmant la possibilité de reconnaissance de l'agent pathogène.

Introduction

Tri à vis sans fin automatique est un peu comme FACS, fonctionnant en mesurant un signal fluorescent dans une vis sans fin (typiquement fournie par l'expression transgénique de protéines rapporteurs) lors de son passage redressé dans un tube, ce qui permet la redirection soit à un tube de collecte / puits ou à un conteneur de déchets selon l' à gating paramètres fixés par le chercheur ^1. Le wormsorter peut faciliter la recherche de plusieurs façons, un exemple de l'employer comme outil d'analyse est une étude qui a suivi les modèles spatio-temporelles de l'activité du promoteur pour près de 1000 gènes ^2.
Cependant, l&#....

Protocol

Une. L'obtention d'une culture synchronisée des jeunes adultes Animaux

1. Grandir vers sur plusieurs plaques NGM ensemencées avec OP50-1 E. colibacilles (10x concentré d'une culture saturée) jusqu'à ce que de nombreux vers ont atteint le stade gravide.
2. Traiter les animaux gravides avec une solution d'oeuf préparation pour obtenir une culture synchronisée (œufs).
3. oeufs de plaque sur plusieurs plaques de 60 mm NGM ensemencées avec 10x concentré OP50-1 à une densité d'environ 150-200 oeufs / plaque.
4. Incuber les plaques à 25 ° C pendant 2 jours (jusque vers ont atteint le L4 - stade jeune adulte).

Results

Lorsque appariés pour l'âge, génétiquement identiques C. elegans sont exposés à P. aeruginosa, une large distribution est observée dans les niveaux de colonisation (Figure 1A). Avec l'aide du protocole décrit ci-séparation efficace contre les vers de noncolonized colonisés peut être réalisé (figure 1B). Contrairement vers noncolonized, vers colonisés montrent des signes de dommages, comme la lenteur et la défécation réduit ^19. Ce dernier peut être une raison.......

Discussion

La méthode que nous décrivons tire parti de marquage fluorescent des entités à l'extérieur de la vis sans fin, pour suivre les interactions entre la vis sans fin et de son environnement. Dans le cas que nous présentons, la séparation a été basée sur l'étiquetage d'un agent pathogène et a été utilisé pour les vers séparées avec lourde charge pathogène de ceux qui n'ont pas (ou lumière) charge. Après l'analyse de l'expression du gène n'a trouvé aucune différence dans les réponses immunitaires e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Tampon	préparé sur place		Recette chez wormbook.org
Rifampicine	Sigma	R3501
Solution de préparation d’œufs	préparée sur place		50 ml d’eau ; 40 ml d’eau de Javel ; 10 ml de plaques d’hydroxyde de sodium 10 N
NGM	préparées sur place		Recette chez wormbook.org
Plaques SKP	préparées sur place		Recette identique à NGM seulement 0,35 % de peptone au lieu de 0,25 % Particules de
test de contrôle	Union Biometrica	310-5071-001