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Neurosciences

Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung

Published: January 23, 2014
doi:
10.3791/51091
, , ,
1Virus and Centromere Team, Centre de Génétique et Physiologie Moléculaire et Cellulaire,CNRS UMR 5534, 2Université de Lyon 1, 3Laboratoire d’excellence,LabEX DEVweCAN, 4Institut de Virologie Moléculaire et Structurale,CNRS UPR 3296, 5Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052,CNRS UMR 5286

Summary

Wir haben eine Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungsprotokoll für den Nachweis eines persistenten DNA-Virus-Genom in Gewebeschnitten von Tiermodellen. Dieses Protokoll ermöglicht das Studium Infektionsprozess von codetection des viralen Genoms, dessen RNA-Produkte, und viralen oder zellulären Proteinen in einzelnen Zellen.

Abstract

Einzelzell codetection eines Gens ist seine RNA-Produkt und zellulären Regulatorproteinen kritisch Genregulation zu studieren. Dies ist eine Herausforderung auf dem Gebiet der Virologie, insbesondere für die Kern replizierende DNA-Viren, die anhaltende Tiermodellen für ihre Studie einzubeziehen. Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) wurde eine lebenslange latente Infektion in peripheren Neuronen. Latenten Virus dient als Reservoir, aus dem es reaktiviert und induziert eine neue Herpes-Episode. Die Zellbiologie der HSV-1-Latenz vor schlecht verstanden, teilweise aufgrund des Fehlens von Methoden zur HSV-1-Genoms in situ in Tiermodellen zu erkennen. Wir beschreiben eine DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)-Ansatz effizient Erfassung geringer Kopien viralen Genomen innerhalb der Abschnitte der neuronalen Gewebe von infizierten Tiermodellen. Die Methode beruht auf Wärmebasis Antigen Demaskierung und direkt markiert hausgemachten DNA-Sonden, oder im Handel erhältliche Sonden. Wir haben eine Dreifach staining Ansatz, der DNA-FISH mit RNA-FISH und Immunfluoreszenz, mit Peroxidase-basierte Signalverstärkung, um jede Anforderung zu erfüllen Färbung. Eine wesentliche Verbesserung ist die Möglichkeit, innerhalb von 10 um Gewebeschnitte, Low-Hintergrundsignale, die bei hoher Auflösung durch konfokale Mikroskopie und konventionellen Weitfeld-Epifluoreszenz abgebildet werden kann, zu erhalten. Zusätzlich war die Dreifachfärbung mit einer Vielzahl von Antikörpern gegen zelluläre und virale Proteine ​​gerichtet. Das komplette Protokoll dauert 2,5 Tage, um Antikörper und Penetration der Sonde im Gewebe unterzubringen.

Introduction

Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) ist eine persistente menschlichen neurotropen Viren, eine langfristige latente Infektion in den Neuronen des trigeminalen Ganglien (TG) des peripheren Nervensystems, von dem es periodisch reaktiviert zu replizieren und zu verbreiten. Die HSV-1-Genom ist ein 150 kb dsDNA Lokalisierungs im Zellkern der Wirts Neuron, wo es bleibt, wie Mehrfach chromatinized Plasmide, die nicht in das Wirtszellgenom integrieren 1,2 haben. Während der Wartezeit wird der HSV-1-Replikationszyklus genetische Programm stark unterdrückt, und die Genexpression der Latenz-assoziierten Transkript (LAT) Ort, aus der Latenz Einrichtung Beginn der Reaktivierung 3 beschränkt. LAT erzeugt einen langen nicht-kodierenden RNA 8,5 kb zu einem großen 2 kb Lasso stabil verarbeitet und mehrere miRNA 4-7. HSV-1-Latenz wird somit durch die Anwesenheit der viralen genomischen DNA-, RNA-LAT, und das Fehlen von nachweisbaren Replikationszyklus Proteine ​​gekennzeichnet.

NHALT "> Tiermodelle, vor allem Maus und Kaninchen, sind experimentelle Modelle rekapituliert einige Features der Latenz in der menschlichen. Eines der Hauptinteressen dieser Modelle ist, dass sie das Studium physiologische Aspekte der HSV-1-Latenz bei immunkompetenten Wirten. In den vergangenen Jahrzehnten Viele experimentelle Werkzeuge, wie beispielsweise gentechnisch veränderte Viren und Mäusen, wurden entwickelt, um die Physiologie, Genetik und Zellbiologie der HSV-1-Latenz, aus tierischem Gewebe zu untersuchen. Bisher wurde viraler genomischer DNA nachgewiesen und durch Southern-Blot quantifiziert und qPCR von TGs dissoziiert. gibt es jedoch noch kein Verfahren zur Verfügung, um HSV-1-Genoms von Gewebeschnitten auf 8. Folglich Latenz wird routinemäßig bei der histologischen Schnitte durch den Nachweis von LAT-RNA durch RNA-in situ-Hybridisierung nicht bewertet erkennen in-situ-Hybridisierung Virusgenom-Nachweis. Da es nicht möglich war, infizierten Zellen zu charakterisieren, basierend auf der Anwesenheit von viralen Genomen, this technische Beschränkung hat einen großen Nachteil für die Analyse von vielen Aspekten der Wirt-Virus-Wechselwirkungen, wie die Beziehung zwischen dem viralen Genom und zelluläre und virale Genexpression oder den Host-Zell-vermittelten Immunantwort 9,10.

Am wichtigsten ist, bleibt die Zelle-zu-Zelle Heterogenität der latenten Infektion relativ unerforscht und gezeigt wurde, ein Schlüsselmerkmal der Latenz in Mäusen und in menschlichen sensorischen Ganglienneuronen in SCID-Mäuse implantiert 11-17 sein. Typischerweise wurde durch qPCR gezeigt, dass die HSV-1-Genom Kopienzahl pro Zelle variiert von 5 bis mehrere hundert. Obwohl LAT wird als Schlüsselregulator der Latenz und Reaktivierung qPCR Daten an isolierten Neuronen und in-situ-PCR zeigte, dass nur eine Teilmenge von latent infizierten Neuronen, so niedrig wie 30%, drückt die LAT-Locus 11,12,18-21. Wie die Wirtszelle und die zelluläre Umgebung innerhalb des Gewebes Auswirkung auf die Virus-Latenz Einrichtung undvirale Genexpression, bleibt unklar. Hier beschreiben wir eine stabile Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)-Verfahren für die effiziente Detektion von niedriger Kopien HSV-1-Genom-DNA in tierischen neuronalen Gewebeschnitten. Diese Methode wurde von uns entworfen und für den Zugriff auf hochauflösende Mikroskopie, die notwendig ist, um die Interaktion des viralen Genoms mit den Wirtszell intra-Kernkomponenten 22 studieren zu bekommen. Zusätzlich beschreiben wir eine Mehrfachfärbung Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis der viralen DNA mit RNA und Proteinen, die ein einzigartiges Werkzeug, um die Virus-Wirt-Wechselwirkungen, die virale Genexpression regulieren beschreiben. Das Verfahren kann auch für eine Vielzahl von Analysen den Nachweis von HSV-1-Genom latent, wie die Quantifizierung infizierten Neuronen in zahlreiche Abschnitte erforderlich angewendet werden. Ein wichtiger Schritt ist, um Antigen-Retrieval-Behandlung gelten die virale DNA-Hybridisierung zugänglich zu machen. Somit könnte das Protokoll auch effizient auf die Detektion seinandere dsDNA-Viren, die derzeit von herkömmlichen DNA-FISH Ansätze in tierischen Geweben nachweisbar sind es nicht.

Protocol

Dieses Verfahren wurde bereits in einer Studie veröffentlicht 22 verwendet. Allgemeine Hintergrund und Beschreibung der konventionellen Manipulation auf der ISH, IF-und FISH, empfehlen wir die folgenden 23 verfügbaren Literatur. 1. Tierinfektions Alle Verfahren, die Versuchstiere entsprach ethischen Fragen von der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Erklärung für den Einsatz von Tieren in der Forschung, und wurden v…

Representative Results

Nach mehreren Monaten umfangreicher Tests, entdeckten wir, dass die Wärme-basierte chemische Demaskierung in-situ-Hybridisierung gemacht latente HSV-1-Genom vorhanden für Leuchtstofflampen. Während des Prozesses haben wir versucht, verschiedene Demaskierung Verfahren und nur Wärme-basierte Behandlungen (dh Erhitzen der Schnitte bis Unter Siedetemperatur in einem Mikrowellenherd) erschien effizient. Wir haben dann testete mehrere Salzpuffern, die routinemäßig in der Immunhistochemie (IHC) und Elek…

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht den Nachweis von HSV-1-Genom latent in Neuronen des neuronalen Mausgewebeschnitten. Unser Verständnis der Wege Regel virale Genexpression wurde durch den Mangel an Verfahren zu HSV-1-Genom-DNA in situ in neuronalen Geweben erkennen beschränkt. Informationen über Genom-Kopienzahl und der Anteil der infizierten Nervenzellen kamen vor allem aus PCR-Analyse auf dissoziiert Neuronen 11,12. Bei der Aufklärung der Rolle der Wirtszellkernarchitektur auf HSV-1-L…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken N. Sawtell (Cincinnati Children s Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio, USA), S. Efstathiou (University of Cambridge, Großbritannien) und James Hill (LSU Health Sciences Center, New Orleans, USA) für die Bereitstellung von Proben von HSV-1 -infizierten Mäusen und Kaninchen sind, und für Reagenzien, H. Masumoto (Kazusa DNA Research Institute, Chiba, Japan) und S. Khochbin (Institut Albert Bonniot, Grenoble, Frankreich) für hilfreiche Diskussionen.

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (ATIP Programm, PL, http://www.cnrs.fr), der Französisch Nationale Forschungsagentur (ANR) (ANR-05-MIIM finanzierten 008-01, CENTROLAT, http://www.agencenationale-recherche.fr ), der FINOVI Foundation ( http://www.finovi.org/:fr:start ), der LABEX DEVweCAN (ANR-10-61-LABX ) der Université de Lyon, im Rahmen des Programms "Investissements d'Avenir "(ANR-11-IDEX-0007) von der ANR betrieben ( http://www.agence-nationale-recherche.fr ), L'Association pour la Recherche contre le Cancer (ARC-7979 und ARC- 4910, http://www.arc-cancer.net ), la Ligue Nationale Contre le Cancer (LNCC, http://www.ligue-cancer.net ) und Inca (EPIPRO Programm http://www.e -cancer.fr ). FC und PL sind CNRS-Forscher.

Materials

Balb/c mice Janvier, France 6 week-old females
HSV-1 strains SC16 strain (wild type) See Labetoule, M. et al. (2003) Invest Ophthalmol Vis Sci 44: 217–225, for details on HSV-1 strain and virus stock preparation.
Ketamine hydrochloride Sigma K2753 Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg)
Xylazine hydrochloride Sigma X1251
Paraformaldehyde (PFA) Sigma 158127 Suspend 4g of PFA in 90mL of water. Add 50µL of 1N NaOH, and heat at 60°C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30min. Add 10mL of 10X PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5mL tubes. Caution. Manipulate under a fume hood.
Physiological Saline Sigma 07982-100TAB-F
1X PBS, pH 7.4 (sterile) Life Technologies 10010-015
Sucrose Sigma 84100 Prepare a 20% sucrose solution in 1X PBS.
Cryosectionning embedding medium – Tissue-Tek OCT Compound – SAKURA 4583
Large vector DNA purification kit Qiagen 12462 To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20°C
Nick translation kit Roche Applied Sciences 10 976 776 001
Cy3-dCTP GE Healthcare PA53021 Protect from light
0.5M EDTA Sigma E6758
G50 Mini spin column GE Healthcare 27-5330-01
Salmon sperm DNA 10mg/mL Invitrogen / Life Technologies 15632-011
Ethanol molecular biology grade Sigma 87047 Prepare a 70% solution
Salmon sperm DNA Invitrogen / Life Technologies 15632-011
Formamid Molecular biology grade Sigma F9037 Caution. Manipulate under fume hood.
HSV-1 biotinylated commercial probe Enzo Life Sciences ENZ-40838
ImmEdge hydrophobic pen Vector Laboratories H-4000
20X Saline Sodium Citrate (SSC) Sigma S6639 Prepare a 2X SSC solution in ddH20.
Triton X-100 Sigma T8787 Prepare a 10% stock solution in water and store at +4°C. Prepare the 0.5% solution in 1X PBS right before use.
10mM sodium citrate pH 6.0 Sigma S1804 Prepare a 100mM stock solution (10X). Weigh 10,5g of citric acid (MW 210.14. Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400mL water. Adjust pH at 6.0 with 1N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500mL with distilled water. Dilute 10 times in distilled water before use.
Acetic Acid Sigma 320099
Methanol, molecular biology grade Sigma 322415
Dextran sulfate – MW 500 000 Euromedex EU0606-A
Denhardt's solution (100X) Euromedex 1020-A
Rubber Cement "FixoGum" Marabut 290110000
DNA purification kit – Qiaquick PCR purification kit – Qiagen 28104
T7 in vitro transcription kit Ambion / Life Technologies AM1314
Biotin-16-UTP Roche Applied Sciences 11388908910
RNA purification mini-column Qiagen 73404
Ribonucleoside Vanadyl Complex New England Biolabs S1402S
H2O2 Sigma H3410 Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light.
Yeast tRNA Invitrogen 15401011 prepare a 10mg/mL solution in RNAse free water
Normal Goat Serum Invitrogen PCN5000
Primary antibodies Any supplier The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)
Secondary fluorescent antibodies Invitrogen / Life Technologies The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are AlexaFluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with AlexaFluor 488 (reference A11001)
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit – Streptavidin + AlexaFluor 350 (blue fluorescence) Invitrogen / Life Technologies #T20937 TSA kits are also available from Perkin Elmer
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit – Streptavidin + AlexaFluor 488 (green fluorescence) Invitrogen / Life Technologies #T20932
Hoechst 33342 Invitrogen / Life Technologies H3570 Prepare a 0.5µg/mL solution in 1X PBS immediatly before use. Discard the remaining solution.
22x50mm coverslip. n°1.5 glass. Electron Microscopy Sciences 72204-04
Mounting medium with anti-fading agent – Vectashield – Vector Laboratories H-1000 Another conventional product is Fluoromount G from electron microscopy Science
Superfrost glass slides FisherScientific 12-550-15
EQUIPMENT
Equipment / material Company Reference Note
Needle for infection Glass micropipette hot drawn. Home made.
Dissection equipement Moria, France Microsurgical scissors and forceps
Peristaltic pump Cole Palmer Instruments Easyload Masterflex
Micro-syringe pump device (Nano Pump) kdScientific KDS310
Cryostat Leica France CM 1510-1
-80 °C freezer Sanyo Ultra Low -80°C
Domestic microwave oven
Dry block heater Eppendorf 022670204
Incubator Slide moat Boekel Scientific 240000
Coplin Jar Dominique Dutscher 68512
Staining glass container Dominique Dutscher 68506
Fluorescent microscope Zeiss The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective x40 LD NeoFluor N.A 0.6, and x100 PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43 and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series

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References

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Catez, F., Rousseau, A., Labetoulle, M., Lomonte, P. Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining. J. Vis. Exp. (83), e51091, doi:10.3791/51091 (2014).
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