蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる
1Virus and Centromere Team, Centre de Génétique et Physiologie Moléculaire et Cellulaire,CNRS UMR 5534, 2Université de Lyon 1, 3Laboratoire d’excellence,LabEX DEVweCAN, 4Institut de Virologie Moléculaire et Structurale,CNRS UPR 3296, 5Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052,CNRS UMR 5286
Summary
我々は、動物モデルの組織切片内の永続的なDNAウイルスゲノムの検出のためのin situハイブリダイゼーションプロトコルにおいて蛍光を確立した。このプロトコルは、ウイルスゲノムのcodetection、そのRNA産物、および単一細胞内のウイルスまたは細胞タンパク質によって感染プロセスを研究できます。
Abstract
遺伝子の単一細胞codetectionは、そのRNA産物と細胞調節タンパク質は、遺伝子発現の調節を研究することが重要です。これはウイルス学の分野での課題であり、特に彼らの研究のための動物モデルを伴う核複製永続DNAウイルスのために。単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）は、末梢神経細胞における生涯潜伏感染を確立します。潜伏ウイルスは再活性化し、新たなヘルペスエピソードを誘導するから貯水池として機能する。 HSV-1の潜伏細胞生物は、動物モデルにおけるin situでの HSV-1ゲノムを検出するための方法の欠如のために部分的には、あまり理解のままである。我々のアプローチは、効率的に感染した動物モデルからの神経組織の切片内の低コピーのウイルスゲノムを検出するin situハイブリダイゼーション （FISH） における DNA-蛍光を記載している。この方法は、熱ベースの抗原アンマスキングに依存しており、直接標識自家製DNAプローブ、または市販のプローブ。我々は、トリプルスタイを開発寧のアプローチは、各染色の要件に対応するために、ペルオキシダーゼベースの信号増幅を用いて、RNA-FISH及び免疫蛍光で、DNA-FISHを組み合わせる。主な改善は、共焦点顕微鏡及び広視野落射蛍光によって、従来の高解像度で画像化することができる10μmの組織切片を、低バックグラウンド信号内に、取得する機能である。さらに、三重染色は、細胞およびウイルスタンパク質に対する抗体の広い範囲で働いていた。完全なプロトコルは、組織の中に抗体およびプローブの侵入に対応するために2.5日かかります。
Introduction
単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）は、複製し、普及するために定期的に再活性化する末梢神経系の三叉神経節（TG）のニューロンの長期潜伏感染を確立し、永続的なヒト神経向性ウイルスである。 HSV-1ゲノムは、宿主細胞ゲノム1,2に統合しない限り多コピーchromatinizedプラスミドを、残っているホストニューロンの核内150キロバイトのdsDNAローカライズです。レイテンシーの間に、HSV-1複製サイクル遺伝的プログラムが強く抑制され、遺伝子発現は、待ち時間設立から再活性化3の開始に潜伏関連転写産物（LAT）遺伝子座に制限されている。 LATは、主要な2キロバイト安定したラリアットに加工ロング8.5キロバイト非コードRNA、およびいくつかのmiRNA 4-7を生成します。 HSV-1待ち時間は、このようにウイルスゲノムDNA、RNA LAT、および検出可能な複製サイクルタンパク質の非存在の存在によって特徴付けられる。
「ontent>動物モデル、主にマウスやウサギは、人間における待ち時間のいくつかの機能をrecapitulating実験モデルである。それらのモデルの主な利益の一つは、彼らが免疫担当宿主におけるHSV-1のレイテンシの生理的な側面を研究できることです。過去数十年にわたってこのような遺伝的に改変されたウイルスおよびマウスなどの多くの実験ツールは、動物組織から、生理学、遺伝学、およびHSV-1の潜伏の細胞生物学を研究するために開発されてきた。これまで、ウイルスゲノムDNAをサザンブロットによって検出および定量し、そして解離のTGからのqPCRはあるが、組織切片8上のin situハイブリダイゼーションにより、HSV-1ゲノムを検出するために利用可能な方法が現在のところ存在しないため、待ち時間は、日常的にではなく、in situハイブリダイゼーション RNAによるLAT RNAを検出することにより、組織切片上で評価されるウイルスゲノムの検出。それは、ウイルスゲノムの存在に基づいて感染細胞を特徴付けるためにTHIのは不可能であったのでの技術的な限界は、ウイルスゲノムおよび細胞およびウイルス遺伝子発現または宿主細胞性免疫応答9,10との間の関係のような宿主-ウイルス相互作用の多くの局面の分析の主な欠点となっている。最も重要なことは、潜伏感染の細胞間不均一性は、比較的未調査のままであり、マウスおよびSCIDマウスに移植したヒト11-17感覚神経節ニューロンにおける待ち時間の重要な特徴であることが示されている。典型的には、細胞あたりのHSV-1ゲノムのコピー数が5から数百まで変化することをqPCRにより示された。 LATが遅延と再活性化の重要な調節因子として表示されますが、孤立したニューロンと、その場のPCR での定量PCRのデータは、潜在的に感染したニューロンのサブセットのみ、と低く、30％は、LAT遺伝子座11,12,18-21を発現することを示した。どのように宿主細胞とウイルス潜伏の確立上の組織への影響内細胞環境とウイルス遺伝子発現は、不明なままである。ここでは、動物の神経組織切片内の低コピーHSV-1のゲノムDNAを効率的に検出する方法（FISH）in situハイブリダイゼーションロバストな蛍光を記載している。この方法は、宿主細胞の核内のコンポーネント22とウイルスゲノムとの相互作用を検討する必要がある高解像度の顕微鏡イメージングへのアクセスを得るために私達によって設計され、使用されている。さらに、我々は、ウイルス遺伝子発現を調節するウイルス – 宿主相互作用を説明するためのユニークなツールであるRNAおよびタンパク質を有するウイルスDNAの同時検出のための複数の染色法を記載している。この方法はまた、多数のセクションに感染したニューロンを定量としてHSV-1潜伏ゲノムの検出を必要とする分析、広い範囲に適用することができる。重要なステップは、ハイブリダイゼーションのウイルスDNAにアクセスできるように、抗原回復処理を適用することです。このように、このプロトコルは、検出に効果的な場合があります現在、動物組織内で従来のDNA-FISHのアプローチでは検出できない、他の二本鎖DNAウイルスの。
Protocol
この方法は、以前に発表された研究22に用いた。 ISH、IFおよび魚を一般的な背景と従来の操作の説明については、以下の利用可能な文献23をお勧めします。 1。動物の感染症実験動物に関わるすべての手順は、ビジョンと眼科の研究のための協会の倫理的な問題のために、研究における動物の使用のために（ARVO）ステートメントを適合?…
Representative Results
広範なテストの数ヶ月後、私たちは、熱系化学アンマスキングは蛍光in situハイブリダイゼーションのための潜伏HSV-1ゲノムが利用できるようにすることを発見した。プロセスの間に、我々は、様々なマスク解除手続きを試みたが、（ すなわち 、電子レンジでサブ沸騰温度までのセクションを加熱する）だけ熱ベースの治療法は、効率的に見えた。私たちは、その後、定?…
Discussion
ここで説明するプロトコルは、マウス神経組織切片のニューロン内のHSV-1潜伏ゲノムの検出を可能にする。ウイルス遺伝子発現を調節する経路の我々の理解は、神経組織内でその場で HSV-1ゲノムDNAを検出する方法の欠如によって制限されてきた。感染した神経細胞のゲノムコピー数及び割合に関する情報は、解離したニューロン11,12上のPCR分析から主になった。 HSV-1の待ち時間?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、HSV-1からのサンプルを提供するためのN.ソーテル（シンシナティ小児病院医療センター、オハイオ州シンシナティ、米国）、S. Efstathiou（英国ケンブリッジ大学）とジェームズ·ヒル（LSU健康科学センター、ニューオーリンズ、米国）に感謝それぞれ、マウスおよびウサギの感染、および試薬のために、有用な議論のためのH·桝本（かずさDNA研究所、千葉県、日本）とS. Khochbin（研究所アルバートBonniot、グルノーブル、フランス）。
この作品は、フランス国立研究機構（ANR）は（ANR-05-MIIM – 、（PLに対してATIPプログラム、http://www.cnrs.fr）センター·国立·デ·ラ·ルシェルシュ科学研究（CNRS）からの補助金によって賄われていた008から01、CENTROLAT、 http://www.agencenationale-recherche.fr ）、FINOVI財団（ http://www.finovi.org/:fr:start ）、LabEX DEVweCAN（ANR-10-LABX-61 ）大学リヨンの、プログラム内の「InvestissemenTS D'アベニール」（ANR-11-IDEX-0007）ANR（が運営http://www.agence-nationale-recherche.fr ）、L'協会（LAルシェルシュコントルルがんを注ぐARC-7979とARC- 4910、 http://www.arc-cancer.net ）、ラ·リーグ国立コントルルがん（LNCC、 http://www.ligue-cancer.net ）、およびINCA（EPIPROプログラム、 http://www.e – cancer.fr ）。FCとPLはCNRSの研究者である。
Materials
| Balb/c mice | Janvier, France | 6 week-old females | |
| HSV-1 strains | SC16 strain (wild type) | See Labetoule, M. et al. (2003) Invest Ophthalmol Vis Sci 44: 217–225, for details on HSV-1 strain and virus stock preparation. | |
| Ketamine hydrochloride | Sigma | K2753 | Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg) |
| Xylazine hydrochloride | Sigma | X1251 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 4g of PFA in 90mL of water. Add 50µL of 1N NaOH, and heat at 60°C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30min. Add 10mL of 10X PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5mL tubes. Caution. Manipulate under a fume hood. |
| Physiological Saline | Sigma | 07982-100TAB-F | |
| 1X PBS, pH 7.4 (sterile) | Life Technologies | 10010-015 | |
| Sucrose | Sigma | 84100 | Prepare a 20% sucrose solution in 1X PBS. |
| Cryosectionning embedding medium – Tissue-Tek OCT Compound – | SAKURA | 4583 | |
| Large vector DNA purification kit | Qiagen | 12462 | To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20°C |
| Nick translation kit | Roche Applied Sciences | 10 976 776 001 | |
| Cy3-dCTP | GE Healthcare | PA53021 | Protect from light |
| 0.5M EDTA | Sigma | E6758 | |
| G50 Mini spin column | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| Salmon sperm DNA 10mg/mL | Invitrogen / Life Technologies | 15632-011 | |
| Ethanol molecular biology grade | Sigma | 87047 | Prepare a 70% solution |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen / Life Technologies | 15632-011 | |
| Formamid Molecular biology grade | Sigma | F9037 | Caution. Manipulate under fume hood. |
| HSV-1 biotinylated commercial probe | Enzo Life Sciences | ENZ-40838 | |
| ImmEdge hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| 20X Saline Sodium Citrate (SSC) | Sigma | S6639 | Prepare a 2X SSC solution in ddH20. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Prepare a 10% stock solution in water and store at +4°C. Prepare the 0.5% solution in 1X PBS right before use. |
| 10mM sodium citrate pH 6.0 | Sigma | S1804 | Prepare a 100mM stock solution (10X). Weigh 10,5g of citric acid (MW 210.14. Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400mL water. Adjust pH at 6.0 with 1N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500mL with distilled water. Dilute 10 times in distilled water before use. |
| Acetic Acid | Sigma | 320099 | |
| Methanol, molecular biology grade | Sigma | 322415 | |
| Dextran sulfate – MW 500 000 | Euromedex | EU0606-A | |
| Denhardt's solution (100X) | Euromedex | 1020-A | |
| Rubber Cement "FixoGum" | Marabut | 290110000 | |
| DNA purification kit – Qiaquick PCR purification kit – | Qiagen | 28104 | |
| T7 in vitro transcription kit | Ambion / Life Technologies | AM1314 | |
| Biotin-16-UTP | Roche Applied Sciences | 11388908910 | |
| RNA purification mini-column | Qiagen | 73404 | |
| Ribonucleoside Vanadyl Complex | New England Biolabs | S1402S | |
| H2O2 | Sigma | H3410 | Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light. |
| Yeast tRNA | Invitrogen | 15401011 | prepare a 10mg/mL solution in RNAse free water |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| Primary antibodies | Any supplier | The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology) | |
| Secondary fluorescent antibodies | Invitrogen / Life Technologies | The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are AlexaFluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with AlexaFluor 488 (reference A11001) | |
| Tyramide Signal Amplification (TSA) kit – Streptavidin + AlexaFluor 350 (blue fluorescence) | Invitrogen / Life Technologies | #T20937 | TSA kits are also available from Perkin Elmer |
| Tyramide Signal Amplification (TSA) kit – Streptavidin + AlexaFluor 488 (green fluorescence) | Invitrogen / Life Technologies | #T20932 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen / Life Technologies | H3570 | Prepare a 0.5µg/mL solution in 1X PBS immediatly before use. Discard the remaining solution. |
| 22x50mm coverslip. n°1.5 glass. | Electron Microscopy Sciences | 72204-04 | |
| Mounting medium with anti-fading agent – Vectashield – | Vector Laboratories | H-1000 | Another conventional product is Fluoromount G from electron microscopy Science |
| Superfrost glass slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| EQUIPMENT | |||
| Equipment / material | Company | Reference | Note |
| Needle for infection | Glass micropipette hot drawn. Home made. | ||
| Dissection equipement | Moria, France | Microsurgical scissors and forceps | |
| Peristaltic pump | Cole Palmer Instruments | Easyload Masterflex | |
| Micro-syringe pump device (Nano Pump) | kdScientific | KDS310 | |
| Cryostat | Leica France | CM 1510-1 | |
| -80 °C freezer | Sanyo | Ultra Low -80°C | |
| Domestic microwave oven | |||
| Dry block heater | Eppendorf | 022670204 | |
| Incubator Slide moat | Boekel Scientific | 240000 | |
| Coplin Jar | Dominique Dutscher | 68512 | |
| Staining glass container | Dominique Dutscher | 68506 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective x40 LD NeoFluor N.A 0.6, and x100 PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43 and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series | |
References
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Citer Cet Article
Catez, F., Rousseau, A., Labetoulle, M., Lomonte, P. Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining. J. Vis. Exp. (83), e51091, doi:10.3791/51091 (2014).