Design und Analyse des Temperaturpräferenzverhaltens und seines circadianen Rhythmus in Drosophila
Summary
Wir haben vor kurzem eine neuartige Drosophila circadiane Ausgabe, Temperaturpräferenz Rhythmus (TPR), in dem die bevorzugte Temperatur in Fliegen steigt während des Tages und fällt während der Nacht identifiziert. TPR wird unabhängig von einem anderen zirkadianen Ausgang, der Motoraktivität, reguliert. Hier beschreiben wir das Design und die Analyse von TPR in Drosophila.
Abstract
Die zirkadiane Uhr reguliert viele Aspekte des Lebens, einschließlich Schlaf, Bewegungsaktivität, und Körpertemperatur (BTR) Rhythmen1,2. Wir identifizierten vor kurzem eine neuartige Drosophila zirkadiane Ausgabe, genannt die Temperaturpräferenz Rhythmus (TPR), in dem die bevorzugte Temperatur in Fliegen steigt während des Tages und fällt in der Nacht 3. Überraschenderweise werden die TPR und die motorische Aktivität durch verschiedene zirkadiane Neuronen3gesteuert. Drosophila-Bewegungsaktivität ist eine bekannte zirkadiane Verhaltensleistung und hat starke Beiträge zur Entdeckung vieler konservierter zirkadianer Uhrgene und-mechanismen4 geleistet. Daher wird das Verständnis von TPR zur Identifizierung bisher unbekannter molekularer und zellulärer zirkadianer Mechanismen führen. Hier beschreiben wir, wie der TPR-Assay durchgeführt und analysiert wird. Diese Technik ermöglicht nicht nur die Sezieren der molekularen und neuronalen Mechanismen von TPR, sondern bietet auch neue Einblicke in die grundlegenden Mechanismen der Gehirnfunktionen, die verschiedene Umweltsignale integrieren und tierseuchenverhalten regulieren. Darüber hinaus deuten unsere kürzlich veröffentlichten Daten darauf hin, dass die Fliegen-TPR Merkmale mit dem Säugetier BTR3teilt. Drosophila sind Ektothermen, bei denen die Körpertemperatur in der Regel verhaltensreguliert ist. Daher ist TPR eine Strategie, die verwendet wird, um eine rhythmische Körpertemperatur in diesen Fliegen5-8zu erzeugen. Wir glauben, dass eine weitere Erforschung von Drosophila TPR die Charakterisierung der Mechanismen erleichtern wird, die der Körpertemperaturkontrolle bei Tieren zugrunde liegen.
Introduction
Temperatur ist ein allgegenwärtiger Umwelthinweis. Tiere zeigen eine Vielzahl von Verhaltensweisen, um schädliche Temperaturen zu vermeiden und bequeme zu suchen. Drosophila weisen ein robustes Temperaturpräferenzverhaltenauf 6,7. Wenn Fliegen in einen Temperaturgradienten von 18-32 °C freigesetzt werden, vermeiden die Fliegen sowohl warme als auch kalte Temperaturen und wählen schließlich eine bevorzugte Temperatur von 25 °C am Morgen3. Die Warmtemperatursensoren sind eine Reihe von thermosensorischen Neuronen, AC-Neuronen, die Drosophila transienten Rezeptor-Potential (TPR) Kanal, TRPA16,9express. Die Kalttemperatursensoren befinden sich in den 3. Antennensegmenten, da das Abtragen der 3. Antennensegmente das Fehlen von Kalttemperaturvermeidung6verursacht. Kürzlich wurde das TRPP-Protein Brivido (Brv) identifiziert10. Da Brv in den 3. Antennensegmenten exprimiert wird und die Kalterkennung vermittelt, ist Brv ein mögliches Kaltsensormolekül, das für das Temperaturpräferenzverhalten entscheidend ist. Insgesamt verwenden die Fliegen diese beiden Temperatursensoren, um die warmen und kalten Temperaturen zu vermeiden und eine bevorzugte Temperatur zu finden.
Während Säugetiere Wärme erzeugen, um ihre Körpertemperatur zu regulieren, passen Ektoremen ihre Körpertemperaturen in der Regel an die Umgebungstemperatur11an. Einige Ektothermen sind dafür bekannt, ein tägliches TPR-Verhalten zu zeigen, von dem angenommen wird, dass es eine Strategie für die Ektothermen ist, ihre BTR12zu regulieren. Um festzustellen, ob die Fliegen TPR aufwiesen, wiederholten wir die Temperaturpräferenz-Verhaltensanalyse an verschiedenen Punkten während einer Spanne von 24 Stunden. Wir fanden heraus, dass Drosophila eine tägliche TPR aufweisen, die morgens niedrig und abends hoch ist und einem ähnlichen Muster wie BTR beim Menschen folgt13.
In Drosophilagibt es 150-Uhr-Neuronen im Gehirn. Die Uhrenneuronen, die die motorische Aktivität regulieren, werden M- und E-Oszillatoren genannt. Interessanterweise regulieren M- und E-Oszillatoren jedoch tPR nicht, stattdessen zeigten wir, dass DN2-Uhrenneuronen im Gehirn TPR regulieren, aber nicht die motorische Aktivität. Diese Daten deuten darauf hin, dass TPR unabhängig von der Motoraktivität reguliert wird. Insbesondere ist die BTR von Säugetieren auch unabhängig von der motorischen Aktivität reguliert. Ablationsstudien an Ratten zeigen, dass BTR durch spezifische SCN-Neuronen gesteuert wird, die auf eine andere Teilmenge subparaventrikulärer Zonenneuronen abzielen als solche, die die motorische Aktivität steuern14. Daher sehen unsere Daten die Möglichkeit in Betracht, dass die Säugetier-BTR und die Fliege TPR evolutionär konserviert sind3, da sowohl Fliegen-TPR als auch Säugetier-BTR zirkadiane uhrabhängige Temperaturrhythmen aufweisen, die unabhängig von der motorischen Aktivität reguliert werden.
Hier beschreiben wir die Details, wie man den TPR-Verhaltenstest in Drosophilaanalysiert. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung nicht nur des molekularen Mechanismus und der neuronalen Schaltkreise von TPR, sondern auch, wie das Gehirn verschiedene Umwelthinweise und innere biologische Uhren integriert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier veranschaulichen wir die Details des Temperaturpräferenzverhaltensapparates und die Analyse des TPR-Verhaltens. Drosophila weist die markanten, robusten und reproduzierbaren Eigenschaften des uhrgesteuerten TPR auf. Unsere Daten deuten jedoch darauf hin, dass mindestens zwei Faktoren, Umgebungslicht und Alter, die TPR-Verhaltensphänotypen erheblich stören.
Wir beobachten, dass Licht die Temperaturpräferenz in Drosophilaerheblich beeinflusst. Es stimmt mit der Tatsach…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind Drs. Aravinthan Samuel und Marc Gershow dankbar, die an der Entwicklung der ursprünglichen Version des Verhaltensapparates mitgewirkt haben, und Matthew Batie, der den Verhaltensapparat modifizierte. Diese Forschung wurde von Trustee Grant von Cincinnati Children es Hospital, JST/PRESTO, March of Dimes und NIH R01 GM107582 to F.N.H. unterstützt.
Materials
| Bright Lab Jr. Safelight | Amazon | #B00013J8UY | Red light for dark rooms |
| Rain X | SOPUS products | Water repellent: Apply the plexiglass cover | |
| C-Clamp | Home Depot | ||
| Temperature/hygrometer | Fisher | 15-077-963 | |
| Peltier devices | TE Technology, Inc. | HP-127-1.4-1.15-71P | |
| Thermometer | Fluke | Fluke 52II | |
| Bench top controller | Oven Industries | 5R6-570-15R and 5R6-570-24R | |
| Temperature sensor probe | Oven Industries | TR67-32 | |
| Generic 480 Watt ATX power supply | computer cooling system | ||
| MCR220-QP-RES Dual 120 mm Radiator with reservoir | Swiftech | computer cooling system | |
| MCP350 In-Line 12V DC pump | Swiftech | computer cooling system | |
| MCW50 graphics Card liquid cooler | Swiftech | computer cooling system | |
| Scythe Kaze-Jyuni SY1225SL12SH fan | Crazy PC | computer cooling system |
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