Projeto e Análise do Comportamento de Preferência de Temperatura e seu Ritmo Circadiano em Drosophila
Summary
Recentemente identificamos uma nova produção circadiana Drosophila, ritmo de preferência de temperatura (TPR), em que a temperatura preferida em moscas sobe durante o dia e cai durante a noite. O TPR é regulado independentemente de outra produção circadiana, atividade locomotor. Aqui descrevemos o desenho e análise do TPR em Drosophila.
Abstract
O relógio circadiano regula muitos aspectos da vida, incluindo sono, atividade locomotor e temperatura corporal (BTR) ritmos1,2. Recentemente identificamos uma nova produção circadiana Drosophila, chamada ritmo de preferência de temperatura (TPR), em que a temperatura preferencial em moscas sobe durante o dia e cai durante a noite 3. Surpreendentemente, a atividade TPR e locomotor são controladas através de neurônios circadianos distintos3. A atividade locomotor de Drosophila é uma produção comportamental circadiana bem conhecida e tem proporcionado fortes contribuições para a descoberta de muitos genes e mecanismos de relógio circadianos conservados4. Portanto, a compreensão do TPR levará à identificação de mecanismos circadianos moleculares e celulares até então desconhecidos. Aqui, descrevemos como executar e analisar o ensaio TPR. Essa técnica não só permite dissecar os mecanismos moleculares e neurais do TPR, mas também fornece novas percepções sobre os mecanismos fundamentais das funções cerebrais que integram diferentes sinais ambientais e regulam comportamentos animais. Além disso, nossos dados publicados recentemente sugerem que a mosca TPR compartilha características com o mamífero BTR3. Drosophila são ectotherms, em que a temperatura corporal é tipicamente regulada comportamentalmente. Portanto, o TPR é uma estratégia usada para gerar uma temperatura corporal rítmica nessas moscas5-8. Acreditamos que uma exploração adicional do Drosophila TPR facilitará a caracterização dos mecanismos subjacentes ao controle da temperatura corporal nos animais.
Introduction
A temperatura é uma sugestão ambiental onipresente. Os animais apresentam uma variedade de comportamentos para evitar temperaturas prejudiciais e buscar os confortáveis. Drosophila apresentam um comportamento robusto de preferência de temperatura6,7. Quando as moscas são liberadas em um gradiente de temperatura de 18-32 °C, as moscas evitam temperaturas quentes e frias e finalmente escolhem uma temperatura preferencial de 25 °C pela manhã3. Os sensores de temperatura quente são um conjunto de neurônios termossensoriais, neurônios AC, que expressam o potencial do receptor transitório Drosophila (TPR), TRPA16,9. Os sensores de temperatura fria estão localizados nos 3º segmentos de antenas, uma vez que a ablação dos 3º segmentos de antenas causa a falta de evasão de temperatura fria6. Recentemente, foi identificada a proteína TRPP Brivido (Brv)10. Como o Brv é expresso nos 3º segmentos de antenas e media a detecção a frio, o Brv é uma possível molécula de sensoriamento a frio, que é fundamental para o comportamento de preferência de temperatura. Em suma, as moscas usam esses dois sensores de temperatura para evitar as temperaturas quentes e frias e encontrar uma temperatura preferida.
Enquanto os mamíferos geram calor para regular sua temperatura corporal, os ectotherms geralmente adaptam suas temperaturas corporais à temperatura ambiente11. Alguns ectotherms são conhecidos por exibir um comportamento diário de TPR que acredita-se ser uma estratégia para os ectotherms para regular seu BTR12. Para determinar se as moscas apresentavam TPR, repetimos a análise comportamental da preferência de temperatura em vários pontos durante um período de 24 horas. Descobrimos que a Drosophila exibe um TPR diário, que é baixo pela manhã e alto à noite e segue um padrão semelhante ao do BTR em humanos13.
Em Drosophila,há ~150 neurônios de relógio no cérebro. Os neurônios do relógio que regulam a atividade locomotor são chamados osciladores M e E. No entanto, curiosamente, os osciladores M e E não regulam tpr, em vez disso, mostramos que os neurônios do relógio DN2 no cérebro regulam a atividade TPR, mas não locomotor. Esses dados indicam que o TPR é regulado independentemente da atividade locomotor. Notavelmente, o BTR mamífero também é regulado independentemente da atividade locomotor. Estudos de ablação em ratos mostram que o BTR é controlado através de neurônios SCN específicos que visam um subconjunto diferente de neurônios de zona subparaventricular do que aqueles que controlam a atividade locomotor14. Portanto, nossos dados consideram a possibilidade de que o MPI mamífero e a mosca TPR sejam evolucionariamente conservados3, uma vez que tanto a mosca TPR quanto a MMH de mamíferos exibem ritmos de temperatura circadianos dependentes do relógio, que são regulados independentemente da atividade locomotor.
Aqui, descrevemos os detalhes de como analisar o ensaio comportamental do TPR em Drosophila. Este método permite a investigação não apenas do mecanismo molecular e circuitos neurais do TPR, mas também de como o cérebro integra diferentes pistas ambientais e relógios biológicos internos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, ilustramos os detalhes do aparato comportamental de preferência de temperatura e análise do comportamento do TPR. Drosophila exibe as características salientes, robustas e reprodutíveis do TPR controlado pelo relógio. No entanto, nossos dados sugerem que pelo menos dois fatores, luz ambiente e idade, perturbam significativamente os fenótipos comportamentais do TPR.
Observamos que a luz afeta significativamente a preferência de temperatura em Drosophila. É consis…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos aos Drs. Aravinthan Samuel e Marc Gershow que ajudaram a desenvolver a versão inicial do aparelho comportamental e Matthew Batie que modificou o aparelho comportamental. Esta pesquisa foi apoiada pelo Trustee Grant do Hospital Infantil de Cincinnati, JST/PRESTO, March of Dimes e NIH R01 GM107582 a F.N.H.
Materials
| Bright Lab Jr. Safelight | Amazon | #B00013J8UY | Red light for dark rooms |
| Rain X | SOPUS products | Water repellent: Apply the plexiglass cover | |
| C-Clamp | Home Depot | ||
| Temperature/hygrometer | Fisher | 15-077-963 | |
| Peltier devices | TE Technology, Inc. | HP-127-1.4-1.15-71P | |
| Thermometer | Fluke | Fluke 52II | |
| Bench top controller | Oven Industries | 5R6-570-15R and 5R6-570-24R | |
| Temperature sensor probe | Oven Industries | TR67-32 | |
| Generic 480 Watt ATX power supply | computer cooling system | ||
| MCR220-QP-RES Dual 120 mm Radiator with reservoir | Swiftech | computer cooling system | |
| MCP350 In-Line 12V DC pump | Swiftech | computer cooling system | |
| MCW50 graphics Card liquid cooler | Swiftech | computer cooling system | |
| Scythe Kaze-Jyuni SY1225SL12SH fan | Crazy PC | computer cooling system |
References
- Krauchi, K. The thermophysiological cascade leading to sleep initiation in relation to phase of entrainment. Sleep Med. Rev. 11, 439-451 (2007).
- Krauchi, K. The human sleep-wake cycle reconsidered from a thermoregulatory point of view. Physiol. Behav. 90, 236-245 (2007).
- Kaneko, H., et al. Circadian Rhythm of Temperature Preference and Its Neural Control in Drosophila. Curr. Biol. 22, 1851-1857 (2012).
- Allada, R., Chung, B. Y. Circadian organization of behavior and physiology in Drosophila. Annu. Rev. Physiol. 72, 605-624 (2010).
- Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis in C. elegans and Drosophila.. Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
- Hong, S. T., et al. cAMP signalling in mushroom bodies modulates temperature preference behaviour in Drosophila. Nature. 454, 771-775 (2008).
- Dillon, M. E., Wang, G., Garrity, P. A., Huey, R. B. Review: Thermal preference in Drosophila. J. Therm. Biol. 34, 109-119 (2009).
- Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and. Nature. 423, 822-823 (2003).
- Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the Drosophila brain. Cell. 144, 614-624 (2011).
- Stevenson, R. D. The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms. Am. Nat. 126 (3), (1985).
- Refinetti, R., Menaker, M. The circadian rhythm of body temperature. Physiol. Behav. 51, 613-637 (1992).
- Duffy, J. F., Dijk, D. J., Klerman, E. B., Czeisler, C. A. Later endogenous circadian temperature nadir relative to an earlier wake time in older people. Am. J. Physiol. 275, 1478-1487 (1998).
- Saper, C. B., Lu, J., Chou, T. C., Gooley, J. The hypothalamic integrator for circadian rhythms. Trends Neurosci. 28, 152-157 (2005).
- Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behaviour associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
- Qiu, J., Hardin, P. E. per mRNA cycling is locked to lights-off under photoperiodic conditions that support circadian feedback loop function. Mol. Cell Biol. 16, 4182-4188 (1996).
- Crocker, A., Sehgal, A. Genetic analysis of sleep. Genes Dev. 24, 1220-1235 (1220).
- Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
- Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287, 1834-1837 (2000).
- Parisky, K. M., et al. PDF cells are a GABA-responsive wake-promoting component of the Drosophila sleep circuit. Neuron. 60, 672-682 (2008).
