En kvantitativ metod för att studera spontan migration av celler i en en-dimensionell begränsas mikromiljö beskrivs. Denna metod drar fördel av mikrofabricerade kanaler och kan användas för att studera migrationen av stort antal celler under olika betingelser i enstaka experiment.
Den metod som beskrivs här tillåter studiet av cellmigration under inneslutning i en dimension. Den är baserad på användningen av mikrotillverkade kanaler, som ställer en polariserad fenotyp till celler av fysiska begränsningar. Väl inne kanaler, celler har bara två möjligheter: flytta framåt eller bakåt. Denna förenklade migration där riktverkan är begränsad underlättar automatisk spårning av celler och utvinning av kvantitativa parametrar för att beskriva cellrörelse. Dessa parametrar inkluderar cellhastighet, riktningsförändringar, och pauser under rörelse. Mikrokanaler är också kompatibla med hjälp av fluorescerande markörer och är därför lämpliga att studera lokalisering av intracellulära organeller och strukturer under cell migration med hög upplösning. Slutligen kan ytan av kanalerna funktionaliseras med olika substrat, vilket möjliggör kontroll av de vidhäftande egenskaperna hos kanalerna eller studiet av haptotaxis. Sammanfattningsvis, systemet here beskrivas är avsett att analysera migration av stora cellantal under förhållanden i vilka både geometrin och den biokemiska naturen av miljön kontrolleras, underlätta normaliseringen och reproducerbarhet oberoende experiment.
Migration är en komplex cellulär funktion som är viktig för många fysiologiska processer i flercelliga organismer, inklusive utveckling, immunsvar, och vävnadsregenerering. Dessutom har vissa patologiska situationer såsom tumörinvasion och metastas är beroende av cellrörlighet 1. Av dessa skäl har cell migration blivit ett stort ämnesområde i samband med både grundläggande och translationell forskning. In vivo är de flesta vävnader kännetecknas av en rik extracellulär matrix och hög celltäthet. Cellmigration därför under fysiologiska förhållanden, förekommer i ett komplex begränsad miljö. Klassiskt, sannolikt på grund av historiska skäl och tekniska begränsningar, cellmigration har studerats i platta 2D-system som inte reproducerar många av miljöegenskaperna finns i vävnader, till exempel fångenskap. Dessutom faktorer såsom celladhesion, som är väsentliga för motilitet i 2D, har nyligen visat sig inte vara nödvändigtvisallt krävs för migration in vivo eller inuti geler, vilket tyder på att de mekanismer som styr cell locomotion i 2D och i andra miljöer är olika 2. Flera system har utvecklats för att efterlikna de komplexa egenskaperna hos vävnader, den mest kända är kollagengeler, som syftar till att rekapitulera egenskaperna för den extracellulära matrisen sammansättningen 3. Här föreslår vi mikrokanaler som en enkel komplementär metod som tillåter studiet cellmigration i en dimension inom en begränsad miljö.
I detta system cellerna vandrar längs mikrokanaler i vilka de kommer in spontant. Flytt celler förvärva då formen på kanalerna, anta en tubulär geometri som troligen förstärker deras polaritet. Den linjära rörelsen av cellerna i kanalerna tillåter spårning automatisk cellen och utvinning av kvantitativa parametrar från experiment. Ur teknisk synvinkel är enkelt och flexibelt detta system. Den coating kanalväggarna kan manipuleras, storleken och formen hos kanalerna kan anpassas, och ett stort antal celler kan analyseras i enstaka experiment. Detta system kan också skalas upp för att göra mediet analys intervall skärm av molekyler som är involverade i cellmotilitet. Protokollet som beskrivs här har standardiserats med hjälp av dendritiska celler (DC) som en cellulär modell. Dessa celler är nyckeln till immunsystemet som de deltar i initiering och underhåll av specifika immunsvar 4. In vitro har DCs visats spontant vandrar i trånga miljöer och är därför en bra modell för att studera cellmotilitet i mikrokanaler 5,6 . Viktigt kan detta system utvidgas till att analysera migration av någon annan motila celltyp såsom T-lymfocyter, neutrofiler, eller tumörceller 7-9.
Här beskriver vi en enhet som består av mikrokanaler som en metod för att studera den flyttande egenskaperna hos ett stort antal celler i enskilda experiment. Detta experimentella system efterliknar de begränsade miljöbegränsningar som finns i vävnader genom endogena vandrande celler. Emellertid, genom att tvinga migration i en enda dimension, det underlättar automatisk spårning cell och utvinning av measurables (Figur 5). Vi visar också att vår enhet är kompatibel med fluorescensmikroskopi …
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner kraftigt PICT IBiSA plattformen vid Institut Curie (CNRS UMR144). Detta arbete har finansierats med bidrag från: Europeiska forskningsrådet till AM.LD (Strapacemi 243103), Association Nationale pour la Recherche (ANR-09-piri-0027-PCVI), den InnaBiosanté stiftelsen (Micemico) till MP och AM. LD och ERC Strapacemi unga utredare bidrag till AM.LD.
PolyDimethylSiloxane (PDMS) | GE Silicones | RTV615 | Package of 90% silicone base and 10% curing agent |
Core sample cutter | Ted Pella Int. | Harris Uni-Core | Diameter 2,5 mm |
Glass-bottom dish | WPI | Fluorodish FD 35-100 | |
Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics | Branson 200 | |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32 G | For small samples (35 dishes). A bigger version is also available |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma Aldrich | F0895 | |
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG) | Susos | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | |
Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
Y27632 | TOCRIS | 1254 |