Studium der Zellmigration in Microfabricated Kanäle

Summary

Ein quantitatives Verfahren zur spontanen Migration von Zellen in einem eindimensionalen beschränkt Mikro studieren beschrieben. Dieses Verfahren nutzt den Vorteil der mikrogefertigten Kanälen und kann verwendet werden, um die Migration der Vielzahl von Zellen unter verschiedenen Bedingungen in einzelnen Experimenten zu untersuchen.

Abstract

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Untersuchung der Zellwanderung unter Einschluss in einer Dimension. Es basiert auf der Verwendung von mikrogefertigten Kanälen, die einen polarisierten Phänotyp Zellen durch physikalische Beschränkungen auferlegen basiert. Einmal in Kanäle, Zellen haben nur zwei Möglichkeiten: vorwärts oder rückwärts zu bewegen. Dies vereinfacht die Migration in dem Richtungs beschränkt erleichtert die automatische Verfolgung von Zellen und die Gewinnung von quantitativen Parameter für Zellbewegung beschreiben. Diese Parameter umfassen Zellgeschwindigkeit, Richtungsänderungen, und Pausen während der Bewegung. Mikrokanäle sind auch bei der Verwendung von Fluoreszenzmarkern kompatibel und eignen sich daher zur Lokalisation von intrazellulären Organellen und Strukturen während der Zellmigration bei hoher Auflösung zu untersuchen. Schließlich kann die Oberfläche der Kanäle mit verschiedenen Substraten funktionalisiert werden, wodurch die Kontrolle der Klebeeigenschaften der Kanäle oder der Untersuchung von Haptotaxis. Zusammenfassend ist das System here beschrieben soll die Migration großer Zellzahlen unter Bedingungen, bei denen sowohl die Geometrie und die biochemische Beschaffenheit der Umgebung gesteuert analysieren, die Erleichterung der Normalisierung und Reproduzierbarkeit der unabhängigen Experimenten.

Introduction

Migration ist eine komplexe zelluläre Funktion, die wichtig für viele physiologische Prozesse in mehrzelligen Organismen, einschließlich der Entwicklung, Immunreaktionen und Geweberegeneration. Darüber hinaus können bestimmte pathologische Situationen wie der Tumorinvasion und Metastasenbildung beruhen auf Zellmotilität ^1. Aus diesen Gründen hat die Zellwanderung zu einem wichtigen Feld der Studie im Rahmen der Grundlagen-und translationalen Forschung. In vivo werden die meisten Gewebe von einem reichen extrazellulären Matrix und hohe Zelldichte aus. Zellmigration daher unter physiologischen Bedingungen tritt in einer komplexen Umgebung beschränkt. Klassisch, wahrscheinlich aus historischen Gründen und technischen Grenzen, Zellmigration hat in flachen 2D-Systemen, die sich nicht fortpflanzen viele der Umgebungseigenschaften in Geweben, wie der Entbindung gefunden sucht. Außerdem Faktoren wie Zelladhäsion, die für Beweglichkeit in 2D sind, wurden kürzlich zeigte nicht necessa seinRily für die Migration in vivo oder in Gelen erforderlich, was darauf hindeutet, dass die Mechanismen, die Zellbewegung in 2D und in anderen Umgebungen herrschen verschieden sind ^2. Verschiedene Systeme wurden entwickelt, um die komplexen Eigenschaften der Gewebe, die bekanntesten sind Kollagengele, die an rekapituliert die Eigenschaften der extrazellulären Matrix ³ zielen imitieren. Hier schlagen wir Mikrokanäle als einfache ergänzende Methode, die die Untersuchung der Zellmigration in einer Dimension unter einer geschlossenen Umgebung ermöglicht.

In diesem System Zellen wandern entlang Mikrokanäle, in die sie spontan ein. Wandernden Zellen erwerben dann die Form der Kanäle, die Annahme eine röhrenförmige Geometrie, die am ehesten verstärkt ihre Polarität. Die lineare Bewegung der Zellen in den Kanälen ermöglicht die automatische Tracking-Zelle und die Gewinnung von quantitativen Parameter aus Experimenten. Aus technischer Sicht ist dieses System einfach und flexibel. Die coating der Kanalwände kann manipuliert werden, die Größe und die Form der Kanäle angepasst werden kann, und eine große Anzahl von Zellen kann in Einzelexperimenten untersucht werden. Dieses System kann auch skaliert-up werden bis mittleren Bereich Bildschirm Analyse von Molekülen in Zellbewegung beteiligt durchzuführen. Das hier beschriebene Protokoll wurde unter Verwendung von dendritischen Zellen (DC) als ein zelluläres Modell standardisiert. Diese Zellen sind der Schlüssel für das Immunsystem, wie sie bei der Initiierung und Aufrechterhaltung von spezifischen Immunantworten beteiligt ^4. In vitro DCs wurde gezeigt, spontan in engen Umgebungen zu wandern und sind daher ein gutes Modell, um die Zellbeweglichkeit in Mikro ^5,6 studieren . Wichtiger ist, kann das System erweitert werden, um die Migration von einem anderen beweglichen Zelltyp als T-Lymphozyten, Neutrophile, oder Tumorzellen ^7-9 analysieren.

Protocol

Wichtiger Hinweis: Dieses Protokoll geht davon aus, dass die Form, die die Form für die gewünschte Mikrokanälen wurde bereits gemacht. Weitere Informationen über die Herstellung der Form wurde bereits veröffentlicht 10. Dieses Protokoll setzt voraus, dass Knochenmark-DCs Kultur bekannt ist. 1. Chipfertigungs Mix PDMS Öl und Härter in einem Gewichtsverhältnis 10.01 Uhr in einem Plastikbecher. Das Vermischen der beiden Verbindungen gründlich. </l…

Representative Results

In jedem Experiment wird die Oberfläche des PDMS mit einem Molekül, das Interesse der Studie geeignet beschichtet. 2 zeigt Kanäle mit einem fluoreszierenden Molekül, PLL-g-PEG beschichtete vor und nach dem Waschen (Schritt 2.4). Ein solches Experiment ermöglicht die Steuerung der Homogenität der Beschichtung in den Kanälen. Nach Beladung der Zellen können Videomikroskopie durchgeführt, um Zellmigration zu folgen. Fig. 3A zeigt ein Beispiel eines DC …

Discussion

Hier beschreiben wir ein Gerät von Mikrokanälen zusammengesetzt als eine Methode, um die Migrationseigenschaften der großen Anzahl von Zellen in einzelnen Experimenten zu untersuchen. Dieses experimentelle System ahmt die begrenzten Umweltauflagen im Gewebe durch endogene wandernden Zellen gefunden. Jedoch durch die Migration zwingt in einer einzigen Dimension, ermöglicht es die automatische Tracking-Zelle und die Gewinnung von Messgrößen (Abbildung 5). Wir zeigen auch, dass unser Gerät ist mit F…

Materials

PolyDimethylSiloxane (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Package of 90% silicone base and 10% curing agent
Core sample cutter	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diameter 2,5 mm
Glass-bottom dish	WPI	Fluorodish FD 35-100
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics	Branson 200
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC 32 G	For small samples (35 dishes). A bigger version is also available
Fibronectin from bovine plasma	Sigma Aldrich	F0895
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254