Исследование клеточной миграции в микроизготовленном каналов

Summary

Количественный метод исследования спонтанной миграцию клеток в одномерном замкнутом микросреды описано. Этот метод использует микроизготовленном каналов и может быть использован для изучения миграции большого числа клеток при различных условиях в отдельных экспериментах.

Abstract

Описанный здесь метод позволяет изучать миграцию клеток в ограниченном объеме в одном измерении. Он основан на использовании микроизготовленном каналов, которые налагают поляризованный фенотип в клетках физическими ограничениями. После того, как внутри каналов, клетки имеют только две возможности: двигаться вперед или назад. Эта упрощенная миграция, в которой направленность ограничена облегчает автоматическое отслеживание клеток и извлечение количественных параметров для описания движения клеток. Эти параметры включают скорость клеток, изменения в направлении и паузы во время движения. Микроканалы также совместимы с использованием флуоресцентных маркеров, поэтому подходят для изучения локализации внутриклеточных органелл и сооружений во время миграции клеток в высоком разрешении. И, наконец, поверхность каналов могут быть функциональными с различными субстратами, что позволяет контролировать адгезионных свойств каналов или изучении haptotaxis. Таким образом, система чпрежде чем описано предназначен для анализа миграции больших количествах клеток в условиях, в которых как геометрия и биохимический характер среды находящимися под контролем, способствуя нормализации и воспроизводимость независимых экспериментов.

Introduction

Миграция представляет собой комплекс клеточные функции, что имеет важное значение для многих физиологических процессов в многоклеточных организмов, в том числе развития, иммунного ответа и регенерации тканей. Кроме того, некоторые патологические состояния, такие как опухолевой инвазии и метастазирования полагаться на клеточной подвижности ^1. По этим причинам, миграции клеток стала одним из основных области исследования в контексте фундаментальных и трансляционных исследований. В естественных условиях, большинство тканей характеризуются богатой внеклеточного матрикса и высокой плотности клеток. Миграция клеток таким образом, в физиологических условиях, происходит в сложном ограниченном окружении. Классически, скорее всего, в силу исторических причин и технических ограничений, миграции клеток изучалось в плоских 2D системах, которые не воспроизводят многие свойства окружающей среды, найденных в тканях, таких как заключения. Кроме того, факторы, как клеточной адгезии, которые необходимы для подвижности в 2D, были недавно показал, чтобы не быть necessaRily требуется для миграции в естественных условиях или внутри гелей, предполагая, что механизмы, которые управляют клеток передвижения в 2D и в других средах различны ^2. Несколько системы были разработаны, чтобы имитировать сложные свойства тканей, самых известных гелей существо коллагена, которые направлены на обобщал свойства внеклеточного матрикса состава ^3. Здесь мы предлагаем микроканалов в качестве простого дополнительного метода, который позволяет миграцию исследование клеток в одном измерении под замкнутом среде.

В этой системе клетки мигрируют вместе микроканалов, в которую они поступают спонтанно. Миграционные клетки затем приобретают форму каналов, приняв трубчатую геометрию, которая, скорее всего, усиливает их полярность. Линейное перемещение клеток в каналах позволяет отслеживать автоматический клеток и извлечение количественных параметров из экспериментов. С технической точки зрения, эта система легко и гибко. Coatinг стенках канала можно манипулировать, размер и форма каналов могут быть адаптированы, и большое количество клеток могут быть проанализированы в отдельных экспериментах. Эта система может быть также уменьшено, чтобы выполнить средний анализ экраном диапазон молекул, участвующих в клеточной подвижности. Протокол, описанный здесь был стандартизирован с использованием дендритных клеток (DC) в качестве клеточной модели. Эти клетки играют ключевую роль в иммунной системе, как они участвуют в инициации и поддержании специфического иммунного ответа ^4. Экстракорпоральное, ДК было показано, спонтанно перейти в закрытых средах и поэтому является хорошей моделью для изучения подвижность клеток в микроканалов ^5,6 . Важно отметить, что эта система может быть расширена для анализа миграции любой другой тип клеток подвижных как Т-лимфоциты, нейтрофилы, или опухолевых клеток ^7-9.

Protocol

Важное примечание: Этот протокол предполагает, что формы, содержащий форму для требуемых микроканалов уже сделан. Дополнительная информация о подготовке пресс-формы уже опубликованы 10. Этот протокол также предполагает, что ДК костного мозга культура известна. <p class="jov…

Representative Results

В каждом эксперименте поверхность PDMS покрыта молекулы, адаптированной к интересам исследования. Рисунок 2 показывает каналы, покрытые флуоресцентной молекулой, PLL-г-PEG, до и после мытья (шаг 2.4). Такой эксперимент позволяет контролировать однородности покрытия в каналах. <p class…

Discussion

Здесь мы опишем устройство состоит из микроканалов в качестве метода изучения миграционных свойств большого количества клеток в отдельных экспериментах. Эта экспериментальная система имитирует замкнутые экологические ограничения, найденные в тканях эндогенными перелетных клеток. …

Materials

PolyDimethylSiloxane (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Package of 90% silicone base and 10% curing agent
Core sample cutter	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diameter 2,5 mm
Glass-bottom dish	WPI	Fluorodish FD 35-100
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics	Branson 200
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC 32 G	For small samples (35 dishes). A bigger version is also available
Fibronectin from bovine plasma	Sigma Aldrich	F0895
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254