תא ההדמיה ממברנה פגיעה ותהליכי subcellular המעורבים בתיקון
Summary
התהליך של ריפוי תאים נפצעו כרוך בסחר של חלבונים מסוימים ותאי subcellular לאתר של פציעת קרום תא. פרוטוקול זה מתאר מבחני כדי לפקח על תהליכים אלה.
Abstract
היכולת של תאים נפצעו לרפא היא תהליך תאי בסיסי, אך מנגנונים תאיים ומולקולריים המעורבים בתאי ריפוי פצוע הם הבינו היטב. הנה מבחני מתוארים כדי לפקח על היכולת וקינטיקה של ריפוי של תאים בתרבית בעקבות פציעה מקומית. הפרוטוקול הראשון מתאר גישה מבוססת נקודת סיום כדי להעריך את יכולת תיקון קרום תא של מאות תאים בו זמנית. הפרוטוקול השני מתאר גישת הדמיה בזמן אמת כדי לפקח על קינטיקה של תיקון קרום תא בתאים בודדים בעקבות פציעה מקומית עם לייזר פעם. ככל שתאי ריפוי נפצע כרוך בסחר של חלבונים מסוימים ותאי subcellular לאתר של פציעה, הפרוטוקול השלישי מתאר את השימוש בגישה מבוססת נקודת סיום לעיל כדי להעריך אירוע אחד כזה סחר (exocytosis lysosomal) במאות תאים נפצעו בו זמנית והפרוטוקול האחרון מתאר את השימוש של פגיעת לייזר פעם יחד עם מיקרו TIRFעותק כדי לפקח על הדינמיקה של תאי subcellular בודדים בתאים שנפגעו ברזולוציה מרחבית ובזמן גבוה. בעוד הפרוטוקולים כאן מתארים את השימוש בגישות אלה כדי לחקור את הקשר בין תיקון קרום התא וexocytosis lysosomal בתאי שריר בתרבית, הם יכולים להיות מיושמים כאמורים לכל תא אחר חסיד תרבותי ותא subcellular של בחירה.
Introduction
קרום תא שומר על שלמותם של תאים על ידי מתן חיץ בין התא לבין סביבת החוץ תאית. גירוי כימי, חשמלי או מכאני שעולה על הסף הפיזיולוגי הנורמלי, כמו גם נוכחותם של פולשים גורמי מחלה יכול כל תוצאה בפגיעה בקרום התא ולגרום לתגובה תאית לאחר לתקן פגיעה זו. כדי לשרוד פציעות אלה לממברנת התא, תאים בעלי מנגנון יעיל לתיקון. מנגנון זה הוא סידן תלוי וכרוך בסחר תאית של חלבונים כגון annexins וMG53 בין יתר, כמו גם תאי subcellular כגון endosomes, lysosomes, שלפוחית Golgi נגזרת ומיטוכונדריה לקרום התא נפגע 1-7. עם זאת, את פרטיו של הרצף של אירועים מולקולריים וsubcellular המעורבים בתיקון קרום תא פגוע נשאר הבינו היטב.
התגובה לתיקון של התא יכולה להיות מופרדת לתוך אוזןly ותגובות מאוחרות. תגובות הראשונות, אשר מתרחשות תוך שניות לזמן בקנה מידה דקות, הן חשובות מאוד בקביעת מהותן של תגובות מאוחרות שהובילו לתיקון תאים מוצלח או מוות של תאים. מבחני נקודת סיום מבוססים על אנליזה ביוכימית והתאית בתפזורת סייעו להקים את מעורבותם של תהליכים מולקולריים ותאיים בתיקון. אבל, בשל ההטרוגניות והמהירות של תגובת תיקון הסלולרי, מבחני נקודת סיום אינם מספקים פרטים הקינטית ומרחבים של הרצף של אירועים שהובילו לתיקון. גישות המאפשרות לפציעה מבוקרת של קרום תא ומאפשרים ניטור ותיקון קרום תא ותגובות subcellular קשורים במרחב ובזמן ברזולוציה גבוהה מתאימות בצורה אידיאלית ללימודים כאלה. הנה, גישות כאלה כבר הוצגו. שניים מפרוטוקולי תיאור גישות לפקח קינטיקה בזמן אמת של תיקון קרום תא ותגובות subcellular הקשורים בתהליך התיקון בתאים חיים הבאות inj הלייזרלסר אורי. כהשלמה למבחנים מבוססי הדמיה תא החי אלה, מבחני נקודת סיום יש גם תוארו המספקים מדד המבוסס אוכלוסייה לתיקון ניטור של תאים בודדים ותגובות subcellular הקשורות. כדי להדגים השירות שלהם גישות אלה היו בשימוש כדי לפקח על סחר וexocytosis של lysosomes בתגובה לפציעת קרום תא.
Protocol
Representative Results
Discussion
פציעת קרום תא in vivo מתרחשת עקב מגוון של גורמי לחץ פיסיולוגיים וכמה גישות ניסיוניות פותחו לחקות אלה. אלה כוללים פצעו קרום תא של תאים חסיד על ידי גירוד אותם מהצלחת או על ידי passaging דרך 9,10 מזרק שעמם צר. בעקבות פציעות כגון התאים לרפא בהשעיה ולא פעל בהתאם למטריצה ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות המענקים AR055686 וAR060836 ומלגה הבתר לספירה על ידי צרפתים ניוון שרירים אגודה (AFM). מתקן ההדמיה הסלולרית מנוצל במחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקי HD040677.
Materials
| HBSS | Sigma | H1387 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| HEPES | Fisher | BP410 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| FITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1820 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| Glass beads | Sigma | G8772 | |
| TRITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1818 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| PFA 16% | EMS | 15710 | 4% in PBS |
| Hoechst | Invitrogen | H3570 | 1/10 000 in PBS |
| FM dye | Invitrogen | T3163 | 1 µg/µl in CIM or PBS |
| FITC dextran | Sigma | FD40S | 2 mg/ml in growth medium |
| LAMP1 | Santa Cruz | sc-19992 | 1/300 in growth medium |
| Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG | Invitrogen | A21470 | 1/500 in blocking solution |
| Mounting media | Dako | S3023 | |
| Coverslips | Fisher | 12-545-86 | |
| Glass bottom petridish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Silicone O ring | Bellco | 1943-33315 | |
| Coverslip holder | Bellco | 1943-11111 | |
| Invitrogen | A-7816 | ||
| DMEM | VWR | 12001-566 | |
| FBS | VWR | MP1400-500H | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Penicillin/Sreptomycin | VWR | 12001-350 | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining |
| PBS (Ca2+ and Mg2+ free) | VWR | 12001-664 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus America, PA | IX81 | |
| TIRF illuminator | Olympus America, PA | Cell^TIRF (IEC60825-1:2007) | |
| Epifluorescence illuminator | Sutter Instruments, Novato CA | Lambda DG-4 (DG-4 30) | |
| CCD Camera | Photometrics, Tucson, AZ | Evolve 512 EMCCD | |
| Image acquisition and anaysis software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Slidebook 5 | |
| Pulsed laser | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Ablate (3iL13) | |
| Stage top incubator | Tokaihit, Japan | INUBG2ASFP-ZILCS |
References
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. Blebbing confers resistance against cell lysis. Death Differ. 18, 80-89 .
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling. Cell Biol. 193, 455-464 (2011).
- Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).
- McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K. Cell wound assays. Protoc. Cell Biol. Chapter 12, (2001).
- McNeil, P. L. Direct introduction of molecules into cells. Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).
- Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. Cell Biol. 168, 429-439 (2005).
- Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).
- Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. 388, 474-478 (1997).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. Current Protocols in Cell Biology. , 4.12.1-4.12.15 (2003).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Imaging single events at the cell membrane. Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).
