Imaging cellemembranen Injury og subcellulære prosesser involvert i reparasjons
Summary
Prosessen med healing skadde celler innebærer smugling av spesifikke proteiner og subcellulære avdelinger til stedet av cellemembranen skade. Denne protokollen beskriver analyser for å overvåke disse prosessene.
Abstract
Muligheten av skadde celler for å helbrede er en grunnleggende cellulære prosessen, men cellulære og molekylære mekanismene som er involvert i healing skadde celler er dårlig forstått. Her assays er beskrevet for å overvåke egenskaper og kinetikk for helbredelse av dyrkede celler etter lokalisert skade. Den første protokollen beskriver et sluttpunkt basert tilnærming for å vurdere cellemembranen reparasjon evne til hundrevis av celler samtidig. Den andre protokoll beskriver en sanntids avbildning tilnærmingen til å overvåke kinetikken til cellemembran reparasjon i de enkelte celler følgende lokalisert skade med en pulset laser. Som healing skadde celler innebærer smugling av spesifikke proteiner og subcellulære avdelinger til skadestedet, beskriver den tredje protokollen bruk av ovennevnte endepunkt basert tilnærming for å vurdere en slik handel hendelse (lysosomal eksocytose) i hundrevis av celler skadet samtidig, og den siste protokoll beskriver bruk av pulset laser skade sammen med TIRF mikroerkopi til overvåke dynamikken i enkelte subcellulære avdelinger i skadde celler med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Mens protokollene her beskriver bruken av disse metoder for å studere sammenhengen mellom cellemembranen reparasjon og lysosomal exocytose i dyrkede muskelceller, kan de anvendes som sådan for en hvilken som helst annen vedheftende dyrket celle, og subcellulære rommet av valget.
Introduction
Cell membranen opprettholder integriteten av celler ved å gi en barriere mellom cellen og det ekstracellulære miljø. En kjemisk, elektrisk eller mekanisk stimulus som overstiger det normale fysiologiske terskelen, så vel som tilstedeværelse av invaderende patogener kan hver resultere i skade på cellemembranen og utløse en påfølgende cellerespons for å reparere skaden. For å overleve disse skadene til cellemembranen, cellene har en effektiv mekanisme for reparasjon. Denne mekanismen er kalsium avhengig og innebærer intracellulær trafficking av proteiner som annexins og MG53 blant andre så vel som subcellulære avdelinger som endosomes, lysosomer, Golgi avledet vesikler og mitokondrier til den skadde cellemembranen 1-7. Men fortsatt detaljene i sekvens av molekylære og subcellulære hendelser involvert i å reparere skadet cellemembranen dårlig forstått.
Cells reparasjon respons kan bli separert i øretly og sene svar. Tidlige tiltak, som oppstår i løpet av sekunder til minutter tidsskala, er enormt viktig for å bestemme arten av sene svar som fører til vellykket celle reparasjon eller celledød. Endepunkts analyser basert på bulk biokjemiske og cellulære analyser har bidratt til å etablere involvering av molekylære og cellulære prosesser i reparasjon. Men, på grunn av heterogeniteten og hurtighet av cellulære reparasjonsrespons, endepunkts assays mislykkes i å gi den kinetiske og romlige informasjon om sekvensen av hendelser som fører til reparere. Tilnærminger som muliggjør kontrollert skade cellemembranen og tillater overvåking cellemembranen reparasjon og tilhørende subcellulære responser ved høy romlig og tidsmessig oppløsning er ideell for slike studier. Her har slike tilnærminger blitt presentert. To av protokollene beskrive framgangsmåter for å overvåke sanntid kinetikk av cellemembranen reparasjon og subcellulære responser knyttet til reparasjonsprosessen i levende celler følgende laser injury. Som et supplement til disse levende celle bildebehandling baserte analyser, har endepunkts analyser også blitt beskrevet som gir en befolkningsbasert mål for overvåking reparasjon av individuelle celler og de tilhørende subcellulære svar. For å demonstrere sin nytte disse tilnærmingene har blitt brukt til å overvåke handel og eksocytose av lysosomer som svar på cellemembranen skade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellemembranen skade in vivo forekommer på grunn av en rekke fysiologiske belastninger og flere eksperimentelle tilnærminger er blitt utviklet for å etterligne disse. Disse inkluderer å skade cellemembran av adherente celler ved å skrape dem av fatet eller ved passering gjennom en trang boring sprøyte 9,10. Etter slike skader cellene gro i suspensjon og ikke levd opp til den ekstracellulære matrise som de vanligvis gjør i vevet. Atter andre, slik som bruken av poredannende toksiner kjemisk fo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants AR055686 og AR060836 og postdoktorstilling til AD av franske muskeldystrofi Association (AFM). Den cellulære bildebehandling anlegget benyttes i denne studien er støttet av National Institutes of Health Grants HD040677.
Materials
| HBSS | Sigma | H1387 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| HEPES | Fisher | BP410 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| FITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1820 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| Glass beads | Sigma | G8772 | |
| TRITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1818 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| PFA 16% | EMS | 15710 | 4% in PBS |
| Hoechst | Invitrogen | H3570 | 1/10 000 in PBS |
| FM dye | Invitrogen | T3163 | 1 µg/µl in CIM or PBS |
| FITC dextran | Sigma | FD40S | 2 mg/ml in growth medium |
| LAMP1 | Santa Cruz | sc-19992 | 1/300 in growth medium |
| Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG | Invitrogen | A21470 | 1/500 in blocking solution |
| Mounting media | Dako | S3023 | |
| Coverslips | Fisher | 12-545-86 | |
| Glass bottom petridish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Silicone O ring | Bellco | 1943-33315 | |
| Coverslip holder | Bellco | 1943-11111 | |
| Invitrogen | A-7816 | ||
| DMEM | VWR | 12001-566 | |
| FBS | VWR | MP1400-500H | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Penicillin/Sreptomycin | VWR | 12001-350 | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining |
| PBS (Ca2+ and Mg2+ free) | VWR | 12001-664 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus America, PA | IX81 | |
| TIRF illuminator | Olympus America, PA | Cell^TIRF (IEC60825-1:2007) | |
| Epifluorescence illuminator | Sutter Instruments, Novato CA | Lambda DG-4 (DG-4 30) | |
| CCD Camera | Photometrics, Tucson, AZ | Evolve 512 EMCCD | |
| Image acquisition and anaysis software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Slidebook 5 | |
| Pulsed laser | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Ablate (3iL13) | |
| Stage top incubator | Tokaihit, Japan | INUBG2ASFP-ZILCS |
References
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. Blebbing confers resistance against cell lysis. Death Differ. 18, 80-89 .
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling. Cell Biol. 193, 455-464 (2011).
- Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).
- McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K. Cell wound assays. Protoc. Cell Biol. Chapter 12, (2001).
- McNeil, P. L. Direct introduction of molecules into cells. Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).
- Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. Cell Biol. 168, 429-439 (2005).
- Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).
- Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. 388, 474-478 (1997).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. Current Protocols in Cell Biology. , 4.12.1-4.12.15 (2003).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Imaging single events at the cell membrane. Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).
