Imaging Cell Membrane Skador och Subcellulära processer som ingår i reparations
Summary
Läkningsprocessen skadade celler innebär handel med specifika proteiner och subcellulära fack till platsen av cellmembranet skada. Detta protokoll beskriver analyser för att övervaka dessa processer.
Abstract
Förmågan hos skadade celler att läka är en grundläggande cellulär process, men cellulära och molekylära mekanismer som är involverade i läkning skadade celler är dåligt kända. Här analyser beskrivs att övervaka förmåga och kinetik av läkning av odlade celler efter lokaliserad skada. Den första protokoll beskriver en slutpunkt baserad metod för att samtidigt bedöma cellmembran reparationsförmåga av hundratals celler. Den andra protokoll beskriver en realtidsavbildningsteknik för att övervaka kinetiken för cellmembran reparation i enskilda celler efter lokal skada med en pulsad laser. Eftersom healing skadade celler innebär handel med specifika proteiner och subcellulära fack till platsen för skadan, beskriver användningen av ovan slutpunkt baserad metod för att bedöma en sådan handel händelse (lysosomala exocytos) i hundratals celler skadade samtidigt och den sista protokollet den tredje protokollet beskriver användningen av pulsad laser skada tillsammans med TIRF microskopia för att övervaka dynamiken i enskilda subcellulära fack i skadade celler med hög spatial och temporal upplösning. Även om protokollen beskriver det användningen av dessa metoder för att studera sambandet mellan cellmembran reparation och lysosomala exocytos i odlade muskelceller, kan de användas som sådan för alla andra anhängare odlade celler och subcellulära fack av val.
Introduction
Cellmembranet upprätthåller integriteten för celler genom att tillhandahålla en barriär mellan cellen och den extracellulära omgivningen. En kemisk, elektrisk eller mekanisk stimulans som överstiger den normala fysiologiska tröskeln samt förekomsten av invaderande patogener kan varje resultat i skada till cellmembranet och utlösa en efterföljande cellulärt svar att reparera denna skada. För att överleva dessa skador till cellmembranet, celler har en effektiv mekanism för reparation. Denna mekanism är kalciumberoende och innebär intracellulär handel med proteiner såsom annexiner och MG53 bland andra samt subcellulära fack såsom endosomer, lysosomer, Golgi härledda vesikler och mitokondrier till den skadade cellmembran 1-7. Dock förblir detaljerna i sekvensen av molekylära och subcellulära händelser för att reparera skadade cellmembran dåligt kända.
Cells reparationssvar kan uppdelas i öratly och sena svar. Tidiga reaktioner, som uppträder inom några sekunder till minuter tidsskala, är oerhört viktiga för att bestämma vilken typ av svar som leder till framgångsrik cell reparation eller celldöd. Slutpunkt analyser baserade på bulk biokemiska och cellulära analyser har bidragit till att fastställa medverkan av molekylära och cellulära processer i reparation. Men, på grund av heterogenitet och snabba cellulära reparationssvar, slutpunkt analyser inte ger de kinetiska och rumsliga detaljer i händelseförloppet som leder till reparation. Tillvägagångssätt som möjliggör kontrollerad skada av cellmembranet och tillåter övervakning av cellmembranet reparation och tillhörande subcellulära svaret vid hög rumslig och tidsmässig upplösning är idealiska för sådana studier. Här har sådana metoder lagts fram. Två av de protokoll som beskriver metoder för att övervaka realtids kinetiken för cellmembran reparation och subcellulära reaktioner i samband med reparationen i levande celler efter laser injury. Som ett komplement till dessa levande cell imaging baserade analyser, har slutpunktanalyser också beskrivits som ger en befolkningsbaserat mått för övervakning reparation av enskilda celler och tillhörande subcellulära svaren. För att visa sin nytta dessa metoder har använts för att övervaka handel och exocytos av lysosomer som svar på cellmembranskada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellmembranskada in vivo uppstår på grund av en mängd olika fysiologiska stressfaktorer och flera experimentella metoder har utvecklats för att efterlikna dem. Dessa inkluderar att skada cellmembran av vidhäftande celler genom att skrapa bort dem från skålen eller genom att passera genom en smal borrning spruta 9,10. Efter sådana skador cellerna läka i suspension och inte vidhäftar till den extracellulära matrisen, som de gör normalt i vävnaden. Ytterligare andra, såsom användning av p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag AR055686 och AR060836 och postdoktorsstipendium till AD av franska muskeldystrofi Association (AFM). Den cellulära avbildning anläggning används i denna studie stöds av National Institutes of Health bidrag HD040677.
Materials
| HBSS | Sigma | H1387 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| HEPES | Fisher | BP410 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| FITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1820 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| Glass beads | Sigma | G8772 | |
| TRITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1818 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| PFA 16% | EMS | 15710 | 4% in PBS |
| Hoechst | Invitrogen | H3570 | 1/10 000 in PBS |
| FM dye | Invitrogen | T3163 | 1 µg/µl in CIM or PBS |
| FITC dextran | Sigma | FD40S | 2 mg/ml in growth medium |
| LAMP1 | Santa Cruz | sc-19992 | 1/300 in growth medium |
| Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG | Invitrogen | A21470 | 1/500 in blocking solution |
| Mounting media | Dako | S3023 | |
| Coverslips | Fisher | 12-545-86 | |
| Glass bottom petridish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Silicone O ring | Bellco | 1943-33315 | |
| Coverslip holder | Bellco | 1943-11111 | |
| Invitrogen | A-7816 | ||
| DMEM | VWR | 12001-566 | |
| FBS | VWR | MP1400-500H | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Penicillin/Sreptomycin | VWR | 12001-350 | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining |
| PBS (Ca2+ and Mg2+ free) | VWR | 12001-664 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus America, PA | IX81 | |
| TIRF illuminator | Olympus America, PA | Cell^TIRF (IEC60825-1:2007) | |
| Epifluorescence illuminator | Sutter Instruments, Novato CA | Lambda DG-4 (DG-4 30) | |
| CCD Camera | Photometrics, Tucson, AZ | Evolve 512 EMCCD | |
| Image acquisition and anaysis software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Slidebook 5 | |
| Pulsed laser | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Ablate (3iL13) | |
| Stage top incubator | Tokaihit, Japan | INUBG2ASFP-ZILCS |
References
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. Blebbing confers resistance against cell lysis. Death Differ. 18, 80-89 .
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling. Cell Biol. 193, 455-464 (2011).
- Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).
- McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K. Cell wound assays. Protoc. Cell Biol. Chapter 12, (2001).
- McNeil, P. L. Direct introduction of molecules into cells. Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).
- Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. Cell Biol. 168, 429-439 (2005).
- Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).
- Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. 388, 474-478 (1997).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. Current Protocols in Cell Biology. , 4.12.1-4.12.15 (2003).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Imaging single events at the cell membrane. Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).
