고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석
Summary
여기서는 작은 간섭 합성 RNA(siRNA), 화학 화합물 및 진균 결핵 돌연변이 라이브러리의 고처리량/고함량 스크린에 적용되는 표현성 분석을 설명합니다. 이 방법은 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광으로 표지된 숙주 세포 내의 형광표지 진균 결핵의 검출에 의존합니다.
Abstract
치료와 백신의 가용성에도 불구하고 결핵 (TB)은 세계에서 가장 치명적이고 광범위한 세균 감염 중 하나입니다. 수십 년 이후, 다중 및 광범위 하 게 약물 저항 하는 긴장의 갑작스런 버스트는 결핵의 제어에 대 한 심각한 위협. 따라서 결핵, 진균 결핵(Mtb)의 원인제에 중요한 새로운 표적과 경로를 식별하고 결핵 치료제가 될 수있는 새로운 화학물질을 찾는 것이 필수적이다. 한 가지 접근법은 건초 더미에서 바늘을 검색 할 수 있도록 대규모 라이브러리의 유전 및 화학 적 스크린에 적합한 방법을 설정하는 것입니다. 이를 위해, 우리는 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광 표지 숙주 세포 내에서 형광 표지 Mtb의 검출에 의존하는 phenotypic 분석법을 개발했습니다. 이러한 시험관 내 분석법은 Mtb의 식민지화 공정을 숙주로 정량화할 수 있으며, siRNA-, 화학 화합물 또는 Mtb 돌연변이 라이브러리의 스크린에 적합한 384웰 마이크로플레이트 포맷에 최적화되었다. 그런 다음 이미지는 다중 파라메트릭 분석을 위해 처리되며, 이는 숙주 세포 내의 Mtb의 발병기에서 추론을 제공합니다.
Introduction
지난 몇 년 동안 보고된 신흥 및 재발하는 전염하는 병원균 중, 진균 결핵(Mtb)은 2011년에 140만 명의 사망자와 870만 건의 새로운 감염을 담당하는 두드러진 장소를 보유하고 있습니다(글로벌 결핵 보고서 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). 다약물 치료의 가용성에도 불구하고, 감염된 사람들의 수는 여전히 증가하고 다중 약물 내성 (MDR) 뿐만 아니라 광범위하게 약물 내성 (XDR) Mtb는 빠르게 전 세계적으로확산1. 더욱이, Mtb 항원의 존재를 고려할 때, 전 세계 인구의 3분의 1이 Mtb에 의해 잠잠하게 감염된 것으로 간주된다는 것이 분명합니다. 따라서 Mtb과 싸우는 새로운 수단이 절실히 필요합니다. 이러한 맥락에서, 우리는 자동화된 공초점 형광 현미경3에의하여 숙주 세포로 Mtb 침입 및 곱셈을 감시에 의존하는 체외 시각적 표현체 분석법을 개발하였다. 384웰 마이크로티터 플레이트에서 자동 이미지 수집 및 분석과 결합하여 분석체의 적응은 화합물, siRNAs 및 세균 돌연변이의 중간 규모의 라이브러리의 고함량/고처리량 스크리닝(HC/HTS)을 허용했습니다. 이 표현성 분석에 게놈 넓은 RNAi 라이브러리의 검사는 따라서 Mtb 인신 매매 및 세포 내 복제에 관련된 주요 호스트 요인뿐만 아니라 결핵 바실러스에 의해 악용 호스트 경로의 용해를 가능하게했다. 이 특정 현상 분석의 또 다른 적응은 Mtb 내 phagosomal 지속성에 필수적인 세균인의 식별을 위한 것이었습니다. 예를 들어, phagosome 성숙의 체포는 대식세포에서 Mtb의 생존 그리고 복제를 용이하게 하는 주요 기계장치 의 한으로 간주됩니다. 형광 표지산산구획에서 Mtb 녹아웃 돌연변이체의 세포외 국소화 모니터링은 생존 과정에 관여하는 세균 유전자의 식별을허용4. 마지막으로, Mtb의 고함량 이미징은 세포내 세균 성장3과같은 다양한 현상을 억제하기 위한 약물 효율을 정량화하는 우수한 방법을 제공한다. 전부, 높은 처리량 표현분석의 이 모형은 결핵에 대하여 약 발견을 가속화하고 이러한 다른 접근에 의해 집합된 데이터는 Mtb에의해 발휘된 호스트 조작의 더 나은 이해에 기여합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 여기에 GFP 표현 Mtb H37Rv 균주를 사용하여 표현 형광 숙주 세포를 감염시키는 표현적 분석에 필요한 방법을 설명, 이는 높은 함량 / 높은 처리량 스크린에 적합하게. 이 프로토콜은 광범위한 화합물, 형광 프로브 및 Mtb 돌연변이체에 적용될 수 있습니다. 위에서 설명한 각 프로토콜에 대해 이미지 수집 전에 고정 및 면역 라벨링 단계를 수행할 수 있습니다. 우리는 이미지를 얻기…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업에 대한 재정 지원은 유럽 공동체 (ERC-STG INTRACELLTB 그랜트 n ° 260901, MM4TB 그랜트 n ° 260872), 기관 국립 드 레체쉬, 페더 (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed), 및 지역 노르드 파스 칼레에 의해 제공되었다. 우리는 플랫폼 BICeL에서 가스파드 딜로이슨, 엘리자베스 베르크마이스터, 안토니노 본지오반니, 프랭크 라폰트의 기술적 도움을 감사하게 인정합니다.
Materials
| µclear-plate black, 384 well | Greiner bio-one | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384 well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white , 384 well-plate | Greiner bio-one | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1X [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1X [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| FICOLL PAQUE PLUS | DUTSCHER | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1X | Life Technologies | 15040033 | Non enzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Non targeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfert, storage and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
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