Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

Summary

De alta resolución de imagen intravital con mejor contraste de hasta 120 m de profundidad en los ganglios linfáticos de ratones adultos se consigue modular espacialmente el patrón de excitación de un multi-focal del microscopio de dos fotones. En 100 m de profundidad se midió resoluciones de 487 nm (laterales) y 551 nm (axial), eludiendo así los límites de dispersión y difracción.

Abstract

Control de la comunicación celular por intravital de tejido profundo de múltiples fotones microscopía es la clave para entender el destino de las células inmunes dentro de muestras de tejido de espesor y órganos en la salud y la enfermedad. Al controlar el patrón de exploración en microscopía de múltiples fotones y la aplicación de algoritmos numéricos apropiados, hemos desarrollado un enfoque de rayas-iluminación, lo que nos permitió lograr 3 veces mejor resolución axial y la mejora de la relación señal a ruido, es decir el contrario, en más de 100 profundidad del tejido micras dentro altamente dispersante tejido de los órganos linfoides en comparación con la microscopía de multi-estándar de fotón. La velocidad de adquisición, así como photobleaching y fotolesiones efectos fueron similares a la técnica basada en la foto-multiplicador estándar, mientras que la profundidad de formación de imágenes era ligeramente inferior debido a la utilización de detectores de campo. Utilizando el enfoque de la iluminación de rayas, somos capaces de observar la dinámica de los depósitos de complejos inmunes en las células dendríticas foliculares secundarias ̵1; en el nivel de un par de moléculas de proteína en los centros germinales.

Introduction

Dos fotones de láser microscopía de barrido (TPLSM), con sus ventajas para la formación de imágenes de los tejidos profundos relacionados con infrarrojos ultracorto excitación pulsada ^1, ha revolucionado nuestra visión sobre los procesos vitales a nivel de células individuales mediante la revelación de la motilidad y la interacción de los diversos patrones subconjuntos de células en animales vivos ^2-5. Sin embargo, la tecnología actual sigue siendo insuficiente para esclarecer los mecanismos de la función del órgano y la disfunción, como requisito previo para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, ya que hace sólo escasa información acerca de las bases moleculares de la respuesta celular en los tejidos en la salud y la enfermedad. La tecnología actual permite sólo una ventana espacial de unos pocos cientos de micras debido a la dispersión y la onda efectos de distorsión del frente sobre la resolución espacial y la relación señal-ruido ^6, que son particularmente evidentes en el tejido altamente compacta de animales adultos. Estos dispersión y oleaje efectos de distorsión del frente se deben a una una gran heterogeneidadd distribución anisotrópica del índice de refracción en el tejido, lo que en un primer paso a un deterioro dependiente de la profundidad de la resolución espacial en 3D y finalmente a la pérdida total de la señal procedente de los fotones de excitación balísticos, es decir, la pérdida de la relación señal-ruido. En términos de biocientífico y aplicaciones de tejido profundo biomédicas, esto significa que la tecnología actual no puede revelar de manera inequívoca la comunicación celular causa una pobre resolución daría lugar a interacciones falsamente positivos, mientras que la disminución de la relación señal-ruido podría provocar que el sistema pasa por alto algunos interacciones entre estructuras tenues.

Con el fin de detectar inequívocamente las interacciones celulares en una forma dinámica, se necesita una resolución espacial muy mejorada profunda dentro del tejido. Las técnicas Nanoscopia potentes introducidos actualmente basándose en algoritmos numéricos especiales, por ejemplo, enfoques estructura de iluminación, en el agotamiento del primer estado excitado, por ejemplo, </em> STED, RESOLFT, o en la localización de la molécula, por ejemplo dSTORM, PALM, han encontrado muchas aplicaciones en las células fijadas, así como en cultivos de células en vivo ^7. Sin embargo, con el fin de extender estas aplicaciones para secciones de tejidos, los tejidos vivos y organismos que todavía tenemos que superar las dificultades técnicas severas. Excitación de dos fotones Sted con diferentes longitudes de onda, así como con una sola longitud de onda (sw2PE-STED) para la excitación y la emisión estimulada se ha aplicado para mejorar la resolución lateral en rodajas de cerebro de ⁸ o en matrices artificiales con células embebidas ^9, respectivamente, en la misma resolución axial como TPLSM estándar. Uso de un fotón STED, la dinámica de las espinas dendríticas podrían ser reflejados en la superficie de la corteza cerebral (hasta 10-15 m de profundidad) en un ratón vivo Thy1 EGFP a una resolución de 67 nm ^10. Una herramienta versátil para la biología del desarrollo es proporcionada por el multifocal microscopía estructurada-iluminación, que proporciona doble mejorado 2Dresolución. Sin embargo, esta técnica sólo se puede utilizar en organismos con una baja propensión de dispersión de la luz, tales como embriones de pez cebra ^11. Sin embargo, ninguna de estas técnicas se puede aplicar en el tejido altamente dispersión de animales adultos en varios cientos de micrómetros, que son modelos importantes para la investigación biomédica y clínica de las enfermedades con inicio después del nacimiento.

Independiente de la aproximación utilizada para calcular la forma de onda frontal de difracción limitada, es decir, la función de dispersión de punto (PSF), después de enfocar a través de una lente, la anchura de la PSF a lo largo del eje óptico (resolución axial) es al menos tres veces más grande que la anchura de fibras discontinuas de poliéster perpendicular al eje óptico (resolución lateral) ^12. Ola distorsiones del frente de diferentes órdenes cuantificados por los coeficientes de Zernike modificar considerablemente la forma del frente de onda de la onda electromagnética enfocada en imágenes de tejido profundo que conduce a mucho más grandes PSF, en especial a lo largo de la ópticaal eje ^13-15. Por lo tanto, tanto las leyes de difracción y los efectos de distorsión del frente de onda apuntan a la resolución a lo largo del eje óptico tal como el factor limitante en la formación de imágenes de tejido profundo. Considerando que las técnicas de Nanoscopia se centran en contrarrestar los límites de difracción sólo, se necesita una tecnología que mejora la resolución y el contraste al contrarrestar tanto la difracción y los efectos de distorsión de la onda frontal axial para intravital de imágenes de alta resolución. Lo ideal sería que esta técnica debe ser también lo suficientemente rápido como para permitir el seguimiento de la dinámica celular.

La corrección en tiempo real de las aberraciones de PSF y pérdida de contraste usando óptica adaptativa en TPLSM ha sido ampliamente estudiado y mejorado en la última década ^13,14,16-18 y por lo tanto es la mejor opción disponible en la actualidad conduce a una mejor gestión de la excitación balístico aquellos fotones ^14. Sin embargo, debido al hecho de que la mayor ola de corrección frente a los enfoques utilizados en óptica adaptativa es iterativo y que HÃve que ser repetido para áreas pequeñas (unos pocos 10 x 10 m ²⁾ debido a la alta heterogeneidad del índice de refracción en el tejido, la velocidad de adquisición es significativamente menor que la necesaria para la motilidad celular de formación de imágenes y la comunicación. Por otra parte, el límite físico de adaptación óptica mejorada TPLSM todavía está determinado por difracción.

La modulación espacial de la iluminación (SPIN) y modulación temporal en el lado de detección (PALA) se han propuesto teóricamente para ser aplicado a la microscopía de escaneo láser para mejorar la resolución. Su aplicación práctica en intravital de imágenes aún queda por demostrar ^19.

En conjunto, hay una gran demanda para el desarrollo de las tecnologías, que mejoran la resolución de imágenes de tejido profundo en vivir los animales adultos. En este trabajo, logramos modulación espacial del patrón de excitación mediante el control del proceso de digitalización en la multi-haz-iluminación rayas multi-fotón láser-smicroscopía enlatado (MB-SI-MPLSM) ^20. Contrariamente a los enfoques iluminación estructurada, en la que la sección transversal del haz de excitación se modula espacialmente, utilizamos solamente el proceso de exploración para lograr la modulación espacial de la excitación. Con la ampliación de la excitación a una longitud de onda más larga, que son capaces de mejorar la resolución espacial y la relación señal-ruido en profundidad de los tejidos de alta dispersión de tejido (por ejemplo, los ganglios linfáticos, el camino libre dispersión de 47 m ^6), independientemente de la óptica señal no lineal que detectamos, por ejemplo, fluorescencia, segunda generación armónica u otra frecuencia de mezcla fenómeno. El uso de este enfoque en longitudes de onda de excitación de hasta 900 nm podemos imagen dinámicamente las estructuras de proteínas celulares en la escala de pocas moléculas en los centros germinales de los ganglios linfáticos de ratón. Por lo tanto, podemos visualizar mejor la interacción entre unidades de antígeno llevar en la superficie de las células dendríticas foliculares y células B en el proceso de sondeo de la lucha contraGen durante la respuesta inmune en los órganos linfoides secundarios.

Protocol

Configuración multihaz para TPLSM rayas-iluminación La configuración se utiliza aquí es un multi-haz de dos fotones microscopio especializado de escaneo láser, como se describió previamente 6,20. El sistema se ilustra en la Figura 1. El enfoque se puede aplicar a otros microscopios de barrido láser de dos fotones, que son capaces de sincronizar la adquisición de la cámara con el movimiento de los espejos galvoscanner, incluso si sólo son capaces de realiza…

Representative Results

La resolución espacial en los ganglios linfáticos Las dimensiones de la función de dispersión de punto efectiva (epsf) corresponden a la resolución espacial de un microscopio 12. Medimos esta función triple dimensión mediante la adquisición de la señal de la segunda generación de armónicos de las fibras de colágeno en los ganglios linfáticos por nuestro MB-SI-TPLSM en comparación con las técnicas establecidas de dos fotones microscopía de escaneo láser, es decir<…

Discussion

El objetivo de formación de imágenes ópticas intravital es visualizar de forma dinámica y funcionalmente la motilidad celular y las interacciones con el fin de comprender la función del órgano en la salud y la enfermedad del tejido y ^5. La tecnología más potente para lograr esto, de múltiples fotones láser microscopía de barrido, todavía tiene que superar las limitaciones relacionadas con las distorsiones de onda frontal, la dispersión, la adquisición lenta, photobleaching y fotodaño, que limit…

Materials

ATTO590 – NSH for coupling	ATTO Tec, Germany	AD-590-35	–
CD21/35 – Fab fragment – ATTO590	DRFZ, Berlin	–	The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.
B1-8 Jk-/- EGFP+	Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US	–	Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).
EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment	StemmCell Technologies, Germany	19854	–
Polystyren beads (605), 0.2 µm	Life Technologies, Germany	F8803	–
Name of Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
TriMScope I	LaVision Biotec, Bielefeld, Germany	–	–
OPO (manual version)	APE, Berlin, Germany	–	–
Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II	Coherent, Duisburg, Germany	–	–
water-immersion objective lens, 20x, NA 0.95, IR, WD 2 mm	Olympus Germany, Hamburg, Germany	–	–