Étiquetage différentiel de surface cellulaire et intériorisé protéines après Anticorps alimentation de Live de culture neurones

Résumé

Nous décrivons un procédé pour marquer la protéine à la surface des neurones vivants en utilisant un anticorps polyclonal spécifique à des épitopes extracellulaires. Protéine liée par l'anticorps sur la surface de la cellule et ensuite internalisée par endocytose peut être distinguée de la protéine restante sur, ou à un trafic, de la surface au cours de l'incubation.

Résumé

Afin de démontrer la localisation à la surface cellulaire d'un récepteur transmembranaire putatif dans des neurones en culture, nous avons appelé la protéine sur la surface des neurones vivants avec un anticorps primaire spécifique dirigé contre une portion extracellulaire de la protéine. Étant donné que les récepteurs sont victimes de trafic vers et depuis la surface, si les cellules sont perméabilisées puis après fixation à la fois à la surface cellulaire et la protéine interne sera détecté par le même anticorps secondaire marqué. Ici, nous avons adapté une méthode utilisée pour étudier le trafic de la protéine («d'alimentation d'anticorps») de façon différentielle des protéines de l'étiquette qui a été internalisée par endocytose au cours de l'étape anticorps d'incubation et de protéines qui soit resté sur la surface de la cellule ou est d'un trafic à la surface au cours de cette période, . La capacité de distinguer ces deux groupes de protéines a été rendu possible grâce à l'incorporation d'une étape de blocage pendant la nuit avec l'anticorps secondaire non marqué très concentré après une incubatio initialen des neurones unpermeabilized avec un anticorps secondaire marqué par fluorescence. Après l'étape de blocage, la perméabilisation des neurones admis détection de la piscine internalisée avec un anticorps secondaire fluorescent marqué avec un fluorophore différent. Grâce à cette technique, nous avons pu obtenir des informations importantes sur la localisation subcellulaire de ce récepteur putatif, révélant qu'il était, en effet, de la traite à la surface cellulaire dans les neurones. Cette technique est largement applicable à toute une gamme de types de cellules et des protéines de surface cellulaire, en fournissant un anticorps approprié à un épitope extracellulaire est disponible.

Introduction

En instituant la fonction des protéines nouvellement identifiées, l'enquête de la localisation subcellulaire et le trafic de la protéine en question peut fournir des indices importants sur le rôle probable / s de ^1,2 de protéine. L'analyse bioinformatique du transcriptome du néocortex développement ³ nous a fourni une liste de gènes présentant une expression altérée au cours de cerveaux de souris corticogenèse. Nous avons alors adopté une approche de coup de grâce de gène de s'assurer que la protéine codée par l'un de ces gènes, sez6, a un rôle clé dans le développement des neurones. Nous avons observé que le gène lié à ....

Protocole

Une. Dissociée de l'hippocampe Neuron Culture

1. Préparer des lamelles de verre (borosilicate):
   1. Laver à l'éthanol à 100%.
   2. Sécher à l'air sous irradiation UV.
   3. Manteau de Poly-D-lysine (0,5 mg / ml dans un tampon de borate 0,15 M, pendant une nuit à 4 ° C).
   4. Le jour suivant (le jour de la culture), laver 3 fois dans du PBS puis enduire de la laminine (2,5 pg / ml, de la laminine de souris normal) + 5% v / v de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur (FCS) dilué dans du PBS pendant 2 h à 37 ° C.
2. Disséquer embryonnaires jour 18 (E18) hippocampes de rats et de recueillir dans PBS contenant ....

Résultats

La technique d'immuno-coloration fluorescente bicolore présenté ici est utile pour le marquage des domaines extracellulaires des protéines transmembranaires dans des cellules vivantes (représenté schématiquement sur ​​la figure 1). Au cours de la période d'incubation, les immunoglobulines se lient les épitopes accessibles et une proportion de la population de molécules de protéine, conjointement avec l'anticorps lié, est endocytose. En outre, la protéine nouvellement synthétisé peut atteindr.......

Discussion

La technique décrite ici est complémentaire de celle de la biotinylation de la surface cellulaire (passé en revue par ARANCIBIA-carcamo et al.) ¹² et elle est la méthode de choix pour la conservation de l'information au sujet de la localisation subcellulaire de la protéine internalisé, pourvu d'un anticorps primaire approprié pour une épitope extracellulaire est disponible. En outre, la quantification du trafic de protéines / internalisation au fil du temps peut être effectué (en fixant des l.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
PBS avec Ca et Mg	Invitrogen	14040182
milieu neurobasal	Invitrogen	21103-049
Supplément de B27	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081
Système de dissociation de la papaïne	Worthington Biochemical Corporation	PDS
Sérum bovin Albumine  ;	Sigma Aldrich Australie	A9418
Hank' ; solution saline équilibrée sans calcium, magnésium, rouge de phénol	Invitrogen (Gibco)	14175-079
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich Australie	P0899
Laminine naturelle de souris	Invitrogen	23017-015	Décongeler sur de la glace avant de faire des aliquotes
Sérum fœtal bovin HyClone	Thermo Fisher
Fluorodésoxyuridine	Sigma Aldrich Australie	F0503
Uridine	Sigma Aldrich Australie	U3003
18 mm Lamelles rondes en verre	Menzel Glä ; ser	CB00180RA1
VECTASHIELD support de montage aqueux	Vector Laboratories	H1400
Âne anti-lapin Dylight 649  ;	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-495-152
AffiniPure Fab fragment Chèvre anti-Lapin 1gG (H+L)  ;	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-007-003
Paraformaldéhyde	Sigma Aldrich Australie	P6148	TOXIQUE - poignée dans la hotte
Triton-X-100	Sigma Aldrich Australie	T8787
Alexa Fluor 488-âne conjugué anti-lapin 2° ;	anticorps Invitrogen - Sondes moléculaires	A21206