Denne protokollen beskriver en eksperimentell prosedyre for rask bygging av kunstige transkripsjonsfaktorer (ATFs) med beslektede GFP journalister og kvantifisering av ATFs evne til å stimulere GFP uttrykk via flowcytometri.
Syntetisk biologi har som mål å rasjonelt designe og bygge syntetiske kretser med ønskede kvantitative egenskaper, samt tilby verktøy for å avhøre strukturen av innfødte kontroll kretser. I begge tilfeller, kan evnen til å programmere genekspresjon på en hurtig og fleksibel måte, uten av-target-effekter, være nyttig. Vi har konstruert gjærstammer inneholdende ACT1 promoter oppstrøms for en URA3 kassett fulgt av ligand-bindende domene av human østrogenreseptor og VP16. Ved å transformere denne stammen med en lineær PCR-produkt inneholdende et DNA-bindende domene og velge mot tilstedeværelsen av URA3, kan et konstitutivt uttrykt kunstig transkripsjonsfaktor (ATF) bli generert ved hjelp av homolog rekombinasjon. ATFs konstruert på denne måte kan aktivere en unik målgenet i nærvær av induser, og dermed eliminere både off-target aktivering og nonphysiological vekstbetingelser som finnes med vanlig brukt conditional genuttrykk systemer. En enkel metode for hurtig bygging av GFP rapportør plasmider som reagerer spesifikt til et opprinnelig eller kunstig transkripsjonsfaktor av interesse er også tilveiebrakt.
Utvikle genetiske brytere i gjær er av stor interesse for både akademisk og industriell forskning. I det ideelle tilfellet, kan genetiske brytere brukes til å aktivere en spesiell genet (eller et sett av gener) bare når dette er ønskelig ved experimenter. En genet kodende sekvens plasseres nedstrøms for en syntetisk promoter uttrykkes ikke i fravær av en induserende molekyl: ved inducer tillegg genet skal bli hurtig uttrykt. Det har nylig blitt vist at en slik bryter kan være konstruert i gjær, hvor det i fravær av induser, viser strekk en sletting fenotype, men i nærvær av induser, er uttrykket aktivert i forhold til nivået av inducer i alle celler 1,2. Historisk sett har betingede uttrykk systemer i gjær støttet seg tungt på nærings-responsive DNA-sekvenser, inkludert den MET, PHO, og GAL arrangører (hvis virksomhet er sensitiv for ekstracellulære nivåer av metionin, fosfat, oggalaktose, henholdsvis). Mens betinget uttrykk kan oppnås, kommer det på bekostning av betydelige mitogen effekt.
Hormonreseptorer som de menneskelige østrogenreseptorer har vist seg å være effektive brytere i eukaryoter 3,4. I fravær av hormon, kan et protein kondensert til et hormon reseptor bli sekvestrert i cytoplasma hvor den kommuniserer med Hsp90 anstand kompleks. Ved binding riktig ligand, gjennomgår reseptoren en konformasjonsendringen, forårsaker den til å bli løst fra Hsp90 anstand komplekse og avslører en kjernefysisk lokalisering signal. For å overholde lokaliserings-dynamikken i en bestemt hormon reseptor-inneholdende protein, laget vi en C-terminal fusjon av Gal4dbd.ER.VP16 (GEV, en syntetisk transkripsjonsfaktor som inneholder Gal4p DNA-bindende domene, det ligandbindende domene av human østrogenreseptor , og VP16) med GFP to. Kjernefysiske lokalisering ble observert i løpet av åtte minutter etter tilsetting avmette mengder av induceren, ß-østradiol, som villtype gjær er fullstendig inert. På denne tiden, de fleste celler har klart synlige aktive transkripsjon nettsteder for GEV målgener (analysert via fluorescens in situ hybridisering) samt fullt modne mRNA 2,5. GEV målgener økt i uttrykket> 2 ganger i løpet av 2,5 min 2,6 (målt ved hjelp av mikromatriser), viser at det tar <2,5 min for det kimære aktivator å translocate til kjernen, binde DNA, og aktivere transkripsjon.
Mens flere andre på-brytere har blitt brukt i gjær som utnytter forskjellige små molekyler eller legemidler (inkludert de klassiske doxycycline baserte svitsjer fra Escherichia coli 7,8 og en indigo basert switch 9 fra Arabidopsis thaliana), har ingen oppnådd hastighet, spesifisitet, eller tetthet av regulering utstilt av hormonbaserte svitsjer. Det er verdt å nevne that rask off-brytere har også blitt utviklet i gjær, og vanligvis jobber ved å fusjonere et gen til en protease eller ubiquitin ligase målretting sekvens 2,10,11,12. Evnen til hurtig å fjerne et målprotein fra cellen letter undersøkelsen av essensielle gener, så vel som gener som er utsatt for genetisk undertrykkelse ved sletting 10..
Metodene som beskrives i denne protokollen, er for å bygge og karakterisere syntetiske on-brytere i gjær. Først viser vi hvordan du raskt generere genomically integrerte fusjon proteiner som består av en DNA-bindende domene av interesse, ligandbindende domenet for menneskelig østrogen reseptor, og VP16 (DBD-EV). Etter vår protokoll, blir fusjonsproteinet uttrykkes fra en ACT1 promoter. Deretter viser vi hvordan du oppretter en beslektet reporter plasmid for ATF og teste dens funksjonalitet ved hjelp av flowcytometri. Selv om vi forestille slike rapportør plasmider anvendt med nye ATFs (figur 1), kan de be brukt som journalister for en innfødt transcriptional aktivator i tillegg. Endelig er detaljene for å teste effekten av ATF aktivisering på cellevekst i 96-brønners plater og for prosjektering induserbar genomisk alleler gitt.
De hormonbaserte brytere er beskrevet her har utallige applikasjoner, fra å studere innfødte cellebiologi å teste muligheten for en DNA-bindende domene av interesse å målrette en DNA sekvens in vivo. Systemet har mange ønskelige funksjoner, inkludert en gradert respons på inducer, rask action, og stram regulering (dvs.. Ingen målbar leakiness, se figur 7). Men det er fortsatt rom for forbedringer og vekst.
Nyere arbeider i syntetisk biologi har lagt vekt multipleksing syntetiske systemer og utvide repertoaret av godt karakterisert, programmerbare DNA deler 16. Uavhengig, betinget uttrykk for tydelige mål gener krever både flere indusere og DNA-bindende domener som mangler overlapp spesifisitet. Tilgjengeligheten av konstruerte og naturlig forekommende reseptorer gir et stort sett av deler som å utvikle nye kunstig transkripsjonsfaktorer. Utviderepertoar av gjensidig ortogonale brytere har blitt sterkt hjulpet av rettet evolusjon nærmer 17,18. Dagens innsats for å omprogrammere ligandbindende spesifisitet av våre kunstige transkripsjonsfaktorer vil bli presentert i fremtiden.
Tidligere har de fenotypiske konsekvenser av genet sletting / overekspresjon blitt grundig studert i gjær 19,20. Imidlertid har det ikke vært lett å studere effekten av uttrykk på forskjellige fenotyper over et område av ekspresjonsnivåene. Et primært trekk ved systemet som presenteres her er dens gradert natur (figur 8). Mens ofte lagt til grunn, kan forholdet mellom genekspresjon og fenotyper av interesse ikke nødvendigvis være monoton. Kunstige transkripsjonsfaktorer slik som Z 3 EV og Z 4 EV vil gjøre oppgaven med å analysere de fenotypiske respons til endringer i genekspresjon ukomplisert.
Til slutt, protokollene diskutereed i dette manuskriptet er for konstruksjon og karakterisering av kunstige transkripsjonsfaktorer som reagerer på β-østradiol, men et viktig alternativ til kjemisk reagerende domener er bruken av lys-reagerende domener (for eksempel PhyB/Pif3, LOV, og BLUF), hvis virksomhet er reversibel uten å forurolige kulturen vekstmedium 21-23. Light-baserte systemer til rette tid og rom kontroll av genekspresjon, protein-protein interaksjoner, ion transport, og enzymatisk aktivitet, som allerede har vist seg kraftig 21-26.
Som konklusjon, har vi presentert fremgangsmåter for rask bygging av induserbare transkripsjonsfaktorer, kunstige i gjær. Denne protokollen gir en mal for deres konstruksjon i forbindelse med beslektede GFP reportere, så vel som fremgangsmåter for analyse av rapportør data ved hjelp av strømningscytometri og analysering av effekten på ATF aktivering på veksten.
The authors have nothing to disclose.
RSM erkjenner midler fra NSF Graduate Research Fellowship. MBN erkjenner midler fra en Lewis-Sigler Fellowship og utrustet gave Peter Lewis. DB erkjenner midler fra NIH (GM046406) National Institute of General Medical Sciences Center for Kvantitativ biologi (GM071508). Vi erkjenner Christina DeCoste for å få hjelp med flowcytometri eksperimenter.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Expand High Fidelity PCR System | Roche | 11 732 650 001 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
Competent E. coli | Life Technologies | 18258-012 | |
Estradiol | Tocris Biosciences | 2824 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201 | |
PBS | Life Technologies | 10010-23 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
clonNAT | Jena Bioscience | AB-102L | |
XbaI | NEB | R0145S | |
NotI-HF | NEB | R3189S | |
CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
Glucose | Fisher Scientific | D15-500 | |
Bacto-Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
Yeast Extract | BD Biosciences | 210929 | |
Agarose | BD Biosciences | 214010 | |
100% Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
G418 | Life Technologies | 11811-031 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
Lithium acetate dihydrate | Sigma-Aldrich | L-6883 | |
Salmon sperm DNA | Sigma-Aldrich | 93283 | |
PEG 3350 | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
Plasmids pMN8 and pMN10; yeast strain yMN15 | Noyes or Botstein labs | ||
Luria Broth | Sigma-Aldrich | L3397 | |
EQUIPMENT: | |||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
LSRII Flow Cyometer | BD Biosciences | Various Models | |
MATLAB or FlowJo | MATLAB or FlowJo | Software for analyzing .FCS files from flow cytometry experiments | |
R | Open Source | For analyzing growth-rate data from plate reader. | |
Falcon Tubes | BD Biosciences | 352052 | |
1.7 ml Eppendorf Tubes | GeneMate | C3262-1 | |
250 ml Shake Flasks | Corning | 4446-250 | |
96-well, flat-bottom plates | Costar | 3635 | |
Plate Reader (Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader) | BioTek | H1MG | |
Breathe-Easy Membranes | Sigma-Aldrich | Z380059-1PAK | |
Thermocycler | various companies | Various models | |
SC-Ura powder | MP Biomedicals | 114410622 | |
5-FOA | Zymo Research | F9001-1 |