Injection systémique de cellules neurales souches / progénitrices chez des souris atteintes d'EAE chronique
Summary
La transplantation de cellules souches / progénitrices neurales (PNJ) détient de grandes promesses en neurologie régénérative. L'administration systémique de PNJ est devenu faible invasive, et thérapeutique très efficace protocole efficace, pour fournir des cellules souches dans le cerveau et la moelle épinière des rongeurs et des primates non humains touchés par les dégâts inflammatoire chronique expérimentale du système nerveux central.
Abstract
Cellules souches / précurseurs neurales (PNJ) sont une source de cellules souches prometteuses pour les approches de transplantation visant à la réparation du cerveau ou de la restauration en neurologie régénérative. Cette directive a surgi de nombreux éléments de preuve que la réparation du cerveau est atteint après la transplantation PNJ focale ou systémique dans plusieurs modèles précliniques de maladies neurologiques.
Ces données expérimentales ont identifié l'itinéraire de livraison de cellule comme l'un des principaux obstacles de thérapies de cellules souches réparatrices pour les maladies du cerveau qui nécessite une évaluation urgente. Intraparenchymateuse greffe de cellules souches représente une approche logique de ces pathologies caractérisées par des lésions cérébrales isolées et accessibles tels que les blessures de la moelle épinière et la maladie de Parkinson. Malheureusement, ce principe est applicable à mal des conditions caractérisées par une nature multifocale, inflammatoire et disséminée (dans le temps et dans l'espace), y compris la sclérose en plaques (MS). En tant que tel, le cerveau ciblage par systlivraison PNJ émique est devenu un peu protocole thérapeutique invasive et efficace pour fournir des cellules du cerveau et la moelle épinière des rongeurs et des primates non humains touchés par les dégâts inflammatoire chronique expérimentale du système nerveux central (SNC).
Cette méthode alternative de livraison de cellule repose sur la pathotropism PNJ, en particulier leur capacité innée à (i) détecter l'environnement via des molécules d'adhésion cellulaire fonctionnels et cytokines et chimiokines inflammatoires récepteurs; (Ii) franchir les barrières anatomiques fuite après administration intraveineuse (iv). Ou intracérébroventriculaire (icv) injection; (Iii) s'accumulent au niveau du site de périvasculaire multiple (s) de inflammatoire cerveau et la moelle épinière des dommages; et (iv) exercer trophique de tissu remarquable et des effets régulateurs immunitaires sur différentes cellules cibles de l'hôte in vivo.
Nous décrivons ici les méthodes que nous avons développées pour la iv. et <em> livraison icv de PNJ syngéniques chez la souris avec l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), comme modèle de démyélinisation inflammatoire chronique du système nerveux central, et envisager la livraison de cellules souches systémique comme une technique utile pour le ciblage sélectif du cerveau enflammé en neurologie régénérative.
Introduction
Des preuves solides ont surgi de in vivo attestant de l'efficacité thérapeutique de la transplantation de cellules somatiques neurales souches / précurseurs (PNJ) dans des modèles animaux de troubles du SNC 1-8. Néanmoins, un certain nombre de questions relatives à la livraison de cellules souches dans l'hôte nécessite un examen attentif avant ces résultats expérimentaux peuvent être convertis en applications cliniques. Un obstacle particulier important vers le développement de (non-hématopoïétiques) réparatrice thérapies de cellules souches pour les maladies inflammatoires chroniques multifocales, cerveau est l'identification de l'itinéraire idéal d'injection PNJ. Une bonne compréhension de la physiopathologie de la maladie ciblée (focale ou multifocale; dégénérative inflammatoire ou primaire primaire), et une analyse prudente des questions de faisabilité et des risques associés aux techniques de livraison sont en identifiant le protocole optimal pour la livraison de cellules souches.
Bien que la focale ( <em> Par exemple. dans le parenchyme du système nerveux) transplantation de cellules souches est une approche logique pour le traitement des maladies du système nerveux central caractérisée par des zones spatialement confinés de dommages (par exemple la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington, le cerveau et la moelle épinière des blessures traumatiques, et accident vasculaire cérébral), la même approche peut s'avérer être pratiquement impossible dans des conditions telles que MS, où un dommage multifocale, chronique, et dans l'espace diffusées CNS s'accumule au fil du temps. Dans ce dernier cas, le ciblage des injections de cellules focales de lésions individuelles est également entravé par la capacité limitée des PNJ transplantés à migrer sur de longues distances dans le parenchyme du SNC, incitant ainsi l'identification de méthodes alternatives, plus appropriés de SNC visant avec greffes NPC moins invasives .
Grande promesse émergé des observations que les PNJ ciblent une tumeur intracrânienne (par exemple. Gliome) chez la souris lorsqu'il est injecté par voie intravasculaire en dehors de la CNS9. Suite à cette séminaldes preuves in vivo de la pathotrophism de cellules souches 10, de nombreuses données ont été accumulées concernant la faisabilité et l'efficacité thérapeutique de la transplantation systémique des PNJ dans les animaux de laboratoire avec l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), comme un modèle de lésions inflammatoires du système nerveux central, soit par voie intraveineuse (iv) ou intracérébroventriculaire (ICV). d'injection PNJ 1,2,5,6,8 .. Nous avons tout d'abord montré que cela dépend de la capacité des PNJ transplantés à cibler et à entrer dans le système nerveux central enflammée, et d'engager ensuite intercellulaire multiple programmes de communication au sein de micro-environnements spécifiques in vivo 11. Afin de cibler spécifiquement le système nerveux central, les PNJ sont livrés directement dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) de circulation par injection icv, ou dans la circulation sanguine par injection intraveineuse. Une fois entré dans la circulation sanguine soit ou CSF, PNJ transplantées interagissent activement avecle cerveau (BHE) ou du sang liquide céphalo-rachidien (BCSFB) des barrières et entrer dans le parenchyme du SNC. Cette interaction entre le greffon NPC et le Bureau (ou BCSFB) est régie par ensemble spécifique de molécules d'adhésion cellulaire de surface PNJ (CAMs) et facilitée par l'expression de niveaux élevés de MCP contre-ligands sur endothéliales / cellules épendymaires activées 12-14. Des exemples de ces cames comprennent le récepteur de l'acide hyaluronique, CD44, et la molécule d'adhésion intercellulaire (ICAM) -1 ligand antigène très tardif (VLA) -4 5,15,16 (qui, dans les leucocytes, sont responsables de l'interaction avec épendymaire activé et des cellules endothéliales), et à un antigène des lymphocytes beaucoup plus faible de mesure associé aux fonctions (LFA) -1 et la glycoprotéine P-sélectine ligand (PSGL) -1. NPC expriment également une large gamme de récepteurs de chimiokine, y compris CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3, et CXCR4 (mais n'expriment pas CCR3 et CCR7), qui sont fonctionnellement actifs, à la fois in vitro et in vivo 5,16. Ainsi, SystemicaNPC lly injectés utilisent ces CAMs, avec G-protein coupled receptor (GPCR), à s'accumuler au niveau de l'inflammation du système nerveux central. Inversement, les PNJ injecté par voie systémique chez des souris en bonne santé ne pas entrer dans le système nerveux central via vasculaire ou des routes spatiales liquide céphalo-rachidien 2. L'inflammation du système nerveux central, ou endothéliale / activation des cellules épendymaires suivante cytokine systémique ou lypopolisaccharide (LPS) injection comme un modèle d'encéphalite induite chimiquement, est donc nécessaire pour l'accumulation de PNJ systémique injectées dans le cerveau et la moelle épinière 2. Ainsi, le ciblage réussi de la CNS avec les thérapies systémiques NPC dépend de l'identification d'une fenêtre spécifique de la maladie de chances (WoO) dont le cerveau et l'environnement de la moelle épinière sont propices à l'accumulation et la migration trans de PNJ. De telles conditions se présentent généralement, dans le contexte de l'inflammation aiguë et subaiguë 17. Une fois après avoir entré le CNS, transplanté PNJ indifférenciéesse sont révélés améliorer les caractéristiques clinico-pathologiques de la souris ainsi que de plus grands primates non humains, atteintes d'EAE. Ceci a été décrit comme dépendant de minime remplacement des cellules 2 et remarquable sécrétion de facteurs immunitaires paracrines réglementaires et neuroprotecteurs dans périvasculaire CNS 2,5,6,18 vs non-SNC zones enflammées 19,20 (par exemple les ganglions lymphatiques) en réponse à la signalisation cellulaire inflammatoire provoquée par l'infiltration des cellules immunitaires 5.
Nous décrivons ici les aspects méthodologiques de l'injection systémique de PNJ somatiques dans un modèle de souris de l'EAE chronique. Plus précisément, nous définissons les protocoles que nous avons établies pour (i) résultent, développer et préparer transplantation PNJ somatiques de la zone sous-ventriculaire (SVZ) des adultes C57BL / 6; (Ii) induire l'EAE chronique chez ces souris et (iii) effectuer thérapeutiquement efficace systémique (iv ou icv) PNJ transplantation isouris nto EAE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Thérapies à base de cellules souches somatiques sont en train de devenir l'une des stratégies les plus prometteuses pour le traitement des troubles du système nerveux central inflammatoires chroniques telles que le MS2 11. Bien que les mécanismes soutenant leurs effets thérapeutiques doivent encore être complètement élucidé, l'impact significatif des PNJ transplantation dans différents modèles expérimentaux de maladies neurodégénératives a donné lieu à la croyance un peu provocateur …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Jayden Smith pour l'examen critique et l'édition de la preuve du manuscrit. Ce travail a reçu le soutien de la National Multiple Sclerosis Society (MNSD, subventions partielles RG-4001-A1), l'Association italienne de la sclérose en plaques (AISM, accorder 2010/R/31), le ministère italien de la Santé (GR08-7), Wings for Life, Banca Agricola Popolare di Ragusa (BAPR), le Conseil européen de la recherche (CER) au titre de l'accord ERC-2010-StG Grant ne le 7ème programme-cadre de la Communauté européenne (CE) 260511-SEM_SEM et (FP7/2007-2013) cadre de l'Accord de don n * °; 280772 – Ione.
Materials
| Cell culture | |||
| EBSS | Sigma | E2888 | |
| L-Cystein | SIGMA-ALDRICH CO LTD | C7352 | |
| Papain | WORTHINGTON | 30H11965 | |
| EDTA | Fisher scientific | D/0700/50 | |
| Mouse NeuroCult basal medium | Stem Cell technologies | 05700 | |
| NeuroCult proliferation supplements | Stem Cell technologies | 05701 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B-1000 | |
| Epidermal growth factor | Peprotech | AF-100-15-1000 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 1514012 | |
| Matrigel (coating solution) | BD biosciences | 354230 | |
| NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) | Stem cell technologies | 05704 | |
| Accumax | eBioscience | 00-4666-56 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca& Mg | PAA LABORATORIES LTD | H15-011 | |
| Myco trace | PAA LABORATORIES LTD | Q052-020 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | |
| immunofluorescence | |||
| Normal goat serum | PAA LABORATORIES LTD | B11-035 | |
| Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether | SIGMA-ALDRICH CO LTD | T8787 | |
| Mouse anti Nestin | Abcam | ab11306 | |
| Rabbit anti GFAP | DAKO | 203344 | |
| Mouse anti Histone H3 (phospho S10) | Abcam | ab14955 | |
| Rabbit anti MAP-2 | Abcam | ab32454 | |
| Rat anti MBP | AbD SEROTEC | MCA409S | |
| Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345 | Millipore | MAB345 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Mounting solution | DAKO | S3023 | |
| EAE | |||
| Freund's Adjuvant Incomplete | SIGMA-ALDRICH CO LTD | F5506 | |
| Mycobacterium tuberculosis | DIFCO | H37Ra | |
| MOG(35–55) | Espikem | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories | 181 | |
| Tissue processing | |||
| Iris scissor straight | Fine Sciences Tolls | 14060-09 | |
| Blunt/bended forceps | Fine Sciences Tolls | 11080-02 | |
| Brain slicer | Zivic instruments | BSMAS005-1 | |
| Surgical blades | Swann-Morton | 324 | |
| P200, P1000 pipettes | |||
| Ketamine (Vetalar) | Boehringer Ingelheim | 01LC0030 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 32371 | |
| Stereotaxic frame | KOPF | Model 900 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7762-04 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SIGMA | 158127 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | vector laboratories | PK-6100 |
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