Die systemische Injektion von Neural Stem / Progenitor-Zellen in Mäusen mit chronischer EAE
Summary
Die Transplantation von neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellen (NPCs) hält große Versprechungen in der regenerativen Neurologie. Die systemische Verabreichung von NPCs ist in effektive, invasiv und therapeutisch sehr wirksam Protokoll wandte sich Stammzellen im Gehirn und Rückenmark von Nagern und Primaten durch experimentelle chronisch entzündliche Schädigung des zentralen Nervensystems betroffen zu liefern.
Abstract
Neuronale Stammzellen / Vorläuferzellen (NPCs) sind eine vielversprechende Quelle für die Stammzelltransplantation Ansätze mit dem Ziel Gehirn Reparatur oder Wiederherstellung in der regenerativen Neurologie. Diese Richtlinie wurde von der umfangreichen Beweise dafür, dass Gehirn Reparatur nach fokaler oder systemische NPC Transplantation in mehreren präklinischen Modellen von neurologischen Erkrankungen erreicht entstanden.
Diese experimentellen Daten wurden die Zellabgabe Route als eine der wichtigsten Hürden der restaurativen Stammzellen Therapien für Erkrankungen des Gehirns, die dringende Beurteilung erfordert identifiziert. DruckmessungVentrikuläre Stammzellentransplantation stellt einen logischen Ansatz zu diesen Pathologien gekennzeichnet durch isolierte und zugänglich Hirnläsionen wie Rückenmarksverletzungen und der Parkinson-Krankheit. Leider ist dieses Prinzip schlecht für Zustände, die durch eine multifokale, entzündliche und verbreitet (sowohl in Zeit und Raum) Art, einschließlich multipler Sklerose (MS). Als solche Gehirn-Targeting durch systemic NPC Lieferung hat sich zu einem niedrigen invasive und therapeutisch wirksame Protokoll zu den Zellen in das Gehirn und Rückenmark von Nagern und Primaten durch experimentelle chronisch entzündliche Schädigung des zentralen Nervensystems (ZNS) betroffen zu liefern.
Dieses alternative Verfahren der Zellabgabe beruht auf der NPC pathotropism, insbesondere ihre angeborene Fähigkeit, (i) Erfassen der Umwelt über funktionelle Zelladhäsionsmoleküle und inflammatorische Zytokin und Chemokin-Rezeptoren; (Ii) überqueren Sie die undichte anatomische Barrieren nach intravenöser (iv.) Oder intracerebroventricular (ICV) Injektion; (Iii) sammeln sich an der Höhe des perivaskulären mehreren Stelle (n) von entzündlichen Hirn-und Rückenmarksverletzungen; und (iv) ausüben bemerkenswerte trophischen Gewebe-und Immun regulatorische Effekte auf verschiedenen Host-Zielzellen in vivo.
Hier beschreiben wir die Methoden, die wir für die iv entwickelt. und <em> ICV Lieferung von syngenen NPCs in Mäusen mit experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), als Modell der chronischen entzündlichen ZNS-Demyelinisierung und sehen die systemische Stammzell Lieferung als wertvolle Technik für die selektive Ausrichtung der entzündeten Gehirn in der regenerativen Neurologie.
Introduction
Starke Beweise von in vivo-Studien zur Bestätigung der therapeutischen Wirksamkeit der Transplantation von neuralen somatischen Stammzellen / Vorläuferzellen (NPC) in Tiermodellen für Erkrankungen des ZNS 1-8 entstanden ist. Dennoch, eine Reihe von Fragen im Zusammenhang mit der Lieferung von Stammzellen in das Wirts erfordern eine sorgfältige Überlegung, bevor diese experimentellen Ergebnisse in klinische Anwendungen umgesetzt werden. Eine besonders erhebliche Hürde für die Entwicklung der (nicht-hämatopoetischen) Stammzellen restaurative Therapien für multifokale, chronisch-entzündliche Erkrankungen des Gehirns ist die Identifizierung der idealen Route der NPC-Injektion. Ein Unternehmen Verständnis der Pathophysiologie der Zielerkrankung (fokale oder multifokale; primäre entzündliche oder degenerative) und einer vorsichtigen Analyse der Machbarkeit und Risikofragen mit den Liefer Techniken verbunden sind, sind bei der Ermittlung der optimalen Protokoll für die Stammzell Lieferung.
Während der Schwerpunkt ( <em> ZB. in das Nervensystem Parenchym) Stammzell-Transplantation ist ein logischer Ansatz für die Behandlung von ZNS-Erkrankungen, die durch räumlich begrenzten Bereichen von Schäden (z. B. Parkinson-und Huntington-Krankheit, Gehirn und Rückenmark traumatische Verletzungen und Schlaganfall), kann die gleichen Ansatz zu beweisen unter Bedingungen, wie MS, wo eine multifokale, chronische und räumlich verbreitet ZNS-Schädigung akkumuliert im Laufe der Zeit praktisch nicht durchführbar. In diesem letzteren Fall wird Targeting Brennzellinjektionen an einzelne Läsionen auch durch die begrenzte Fähigkeit der transplantierten NPC gehinderte lange Strecken innerhalb des ZNS wandern über Parenchym, so veranlasst die Identifizierung von alternativen, geeigneten Methoden von ZNS-Targeting mit weniger invasiven NPC Transplantationen .
Große Versprechen, entstand aus den Beobachtungen, die NPCs Ziel eine intrakranielle Tumor (z. B.. Gliom) bei Mäusen, wenn außerhalb der CNS9 intravasal injiziert. Nach dieser bahnbrechendenIn-vivo-Nachweis der Stammzellen pathotrophism 10, umfangreiche Daten akkumuliert worden sind in Bezug auf die Machbarkeit und die therapeutische Wirksamkeit des systemischen Transplantation von NSC in Labortieren mit experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), ein Modell für entzündliche ZNS-Schädigung, entweder über intravenöse (iv) oder intracerebroventricular (ICV). NPC Injektion 1,2,5,6,8 .. Wir haben zuerst gezeigt, dass dies abhängig von der Fähigkeit der transplantierten NPCs zum Ziel und geben Sie die entzündeten ZNS, und anschließend mehrere inter engagieren Kommunikationsprogramme in spezifischen Mikroumgebung in vivo 11. Um speziell auf die ZNS, NPCs sind direkt in die Rückenmarksflüssigkeit (CSF) Zirkulation durch icv Injektion oder in die Blutbahn über iv Injektion verabreicht. Nach Eingabe entweder die Blutbahn oder CSF, transplantiert NPCs interagieren aktiv mitdie Blut-Hirn-(BBB) oder Blut Liquor (BCSFB) Barrieren und geben Sie die ZNS-Parenchym. Diese Wechselwirkung zwischen dem Transplantat und der NPC BBB (oder BCSFB) von bestimmten Satz von NPC Oberfläche Zelladhäsionsmoleküle (CAMs) geregelt und durch die Expression von großen Mengen von CAM Gegenliganden auf aktivierten Endothelzellen / Ependymzellen 12-14 erleichtert. Beispiele für diese Nocken umfassen, die den Rezeptor für Hyaluronat, CD44, und die interzelluläre Adhäsionsmolekül (ICAM) -1 Ligand sehr späten Antigens (VLA) -4 5,15,16 (dh, in Leukozyten, sind verantwortlich für die Interaktion mit aktivierten Ependymzellen und Endothelzellen), und zu einem viel geringeren Ausmaß Lymphozytenfunktion-assoziiertes Antigen (LFA) -1 und P-Selektin-Glykoprotein-Liganden (PSGL) -1. NPCs eine breite Palette von Chemokin-Rezeptoren, einschließlich CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3 und CXCR4 Ausdruck auch (aber nicht ausdrücken, CCR3 und CCR7), die funktionell aktiv sind, sowohl in vitro als auch in vivo 5,16. So SYSTEMICALLY injiziert NSC verwenden diese Nocken, zusammen mit G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR), die auf Ebene des entzündeten ZNS ansammeln. Umgekehrt injiziert NPCs systemisch in gesunden Mäusen nicht in das ZNS über vaskuläre oder Zerebrospinalflüssigkeit Platz zwei Routen. CNS-Entzündung, oder Endothelzellen / ependymalen Zellaktivierung nach einer systemischen Cytokin oder lypopolisaccharide (LPS) Injektion als Modell für chemisch induzierte Enzephalitis, ist daher für die Akkumulation von systemisch injiziert NSC in das Gehirn und das Rückenmark 2 erforderlich. So erfolgreich Targeting des ZNS mit systemischen Therapien NPC abhängig von der Identifikation eines krankheitsspezifischen Zeitfenster (woo) in das Gehirn und das Rückenmark Umwelt sind förderlich für die Akkumulation und die transendotheliale Migration von NSC. Solche Bedingungen entstehen in der Regel im Rahmen der akuten und subakuten Entzündungs 17. Sobald er die CNS eingegeben, transplantierten undifferenzierten NPCsEs ist gezeigt worden, um die klinisch-pathologischen Merkmale von Mäusen als auch größere, nicht-menschlichen Primaten, die mit EAE verbessern. Dies wurde beschrieben abhängig von minimalen Zellenwechsel 2 und bemerkenswerte Sekretion von immunregulatorische und neuroprotektive parakrine Faktoren innerhalb perivaskuläre CNS 2,5,6,18 vs nicht-entzündeten Bereichen ZNS 19,20 (zB Lymphknoten) in Reaktion auf das zu sein, Entzündungszellsignalisierung durch Infiltration Immunzellen 5 ausgelöst.
Hier beschreiben wir die wichtigsten methodischen Aspekte der systemischen Injektion von somatischen NPCs in einem Mausmodell der chronischen EAE. Genauer gesagt, definieren wir die Protokolle, die wir haben, um (i) gegründet ableiten, erweitern und die Vorbereitungen für die Transplantation somatischer NPCs aus dem Subventrikularzone (SVZ) der erwachsenen C57BL / 6 Mäusen; (Ii) induziert chronische EAE in solchen Mäusen und (iii) durchzuführen therapeutisch wirksame systemische (iv oder ICV) NPC Transplantation into EAE Mäusen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Somatische Stammzelltherapien sind als einer der vielversprechendsten Strategien zur Behandlung von chronisch-entzündlichen ZNS-Erkrankungen wie MS2 11 entstehen. Während die Mechanismen Erhaltung ihrer therapeutischen Wirkungen vollständig aufgeklärt werden müssen, noch hat die wesentlichen Auswirkungen der NPC-Transplantation in verschiedenen experimentellen Modellen neurodegenerativer Erkrankungen Anlass zu der etwas provokanten Überzeugung, dass Zellen können bald in Studien am Menschen angewendet …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Jayden Smith für die kritische Prüfung und der Nachweis der Bearbeitung des Manuskripts. Diese Arbeit Unterstützung von der National Multiple Sclerosis Society (NMSS, Teilstipendien RG-4001-A1) erhalten hat, die Italienische Multiple Sklerose Vereinigung (AISM gewähren 2010/R/31), dem italienischen Gesundheitsministerium (GR08-7), Wings for Life, die Banca Agricola Popolare di Ragusa (BAPR), des European Research Council (ERC) im Rahmen des ERC-2010-StG Finanzhilfevereinbarung Nr. 260511-SEM_SEM und die Europäische Gemeinschaft (EG) 7. Rahmenprogramm (FP7/2007-2013) unter Grant Agreement n * deg; 280772 – Ione.
Materials
| Cell culture | |||
| EBSS | Sigma | E2888 | |
| L-Cystein | SIGMA-ALDRICH CO LTD | C7352 | |
| Papain | WORTHINGTON | 30H11965 | |
| EDTA | Fisher scientific | D/0700/50 | |
| Mouse NeuroCult basal medium | Stem Cell technologies | 05700 | |
| NeuroCult proliferation supplements | Stem Cell technologies | 05701 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B-1000 | |
| Epidermal growth factor | Peprotech | AF-100-15-1000 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 1514012 | |
| Matrigel (coating solution) | BD biosciences | 354230 | |
| NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) | Stem cell technologies | 05704 | |
| Accumax | eBioscience | 00-4666-56 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca& Mg | PAA LABORATORIES LTD | H15-011 | |
| Myco trace | PAA LABORATORIES LTD | Q052-020 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | |
| immunofluorescence | |||
| Normal goat serum | PAA LABORATORIES LTD | B11-035 | |
| Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether | SIGMA-ALDRICH CO LTD | T8787 | |
| Mouse anti Nestin | Abcam | ab11306 | |
| Rabbit anti GFAP | DAKO | 203344 | |
| Mouse anti Histone H3 (phospho S10) | Abcam | ab14955 | |
| Rabbit anti MAP-2 | Abcam | ab32454 | |
| Rat anti MBP | AbD SEROTEC | MCA409S | |
| Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345 | Millipore | MAB345 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Mounting solution | DAKO | S3023 | |
| EAE | |||
| Freund's Adjuvant Incomplete | SIGMA-ALDRICH CO LTD | F5506 | |
| Mycobacterium tuberculosis | DIFCO | H37Ra | |
| MOG(35–55) | Espikem | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories | 181 | |
| Tissue processing | |||
| Iris scissor straight | Fine Sciences Tolls | 14060-09 | |
| Blunt/bended forceps | Fine Sciences Tolls | 11080-02 | |
| Brain slicer | Zivic instruments | BSMAS005-1 | |
| Surgical blades | Swann-Morton | 324 | |
| P200, P1000 pipettes | |||
| Ketamine (Vetalar) | Boehringer Ingelheim | 01LC0030 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 32371 | |
| Stereotaxic frame | KOPF | Model 900 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7762-04 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SIGMA | 158127 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | vector laboratories | PK-6100 |
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