Una Lesión álcalis quemar modelo de neovascularización corneal en el ratón
Summary
La neovascularización (NV) de la córnea puede complicar múltiples patologías visuales. Utilizando un modelo de lesión de álcali-quema controlada, un nivel cuantificable de NV corneal puede ser producido para el estudio mecanicista de la NV corneal y la evaluación de posibles terapias para trastornos neovasculares.
Abstract
En condiciones normales, la córnea es avascular, y esta transparencia es esencial para mantener una buena agudeza visual. La neovascularización (NV) de la córnea, que puede ser causada por un traumatismo, queratoplastia o enfermedad infecciosa, se rompe el llamado "privilegio angiogénico 'de la córnea y constituye la base de múltiples patologías visuales que pueden incluso conducir a la ceguera. Aunque hay varias opciones de tratamiento disponibles, la necesidad médica fundamental presentado por patologías corneales neovasculares permanece insatisfecha. Con el fin de desarrollar terapias seguras, eficaces y selectivos, se requiere un modelo fiable de NV de la córnea y la intervención farmacológica. Aquí se describe un modelo de neovascularización corneal lesiones álcalis quemadura en el ratón. Este protocolo proporciona un método para la aplicación de una lesión alcalino-quema controlada a la córnea, la administración de un compuesto farmacológico de interés, y la visualización del resultado. Este método podría ser instrumentalTal para el estudio de los mecanismos y oportunidades para la intervención en NV corneal y otros trastornos neovasculares.
Introduction
Ceguera corneal es la cuarta causa más común de ceguera, responsable de aproximadamente el 4% de todos los casos 1. La neovascularización corneal (NV) desempeña un papel importante en muchas de estas patologías, incluyendo la queratitis herpética (la principal causa infecciosa de ceguera en Occidente) y el tracoma (la causa principal de ceguera en todo el mundo infecciosa) 2. Las terapias actuales incluyen esteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINEs), las terapias anti-VEGF, y ciclosporina A, así como las técnicas quirúrgicas convencionales o láser 3. Sin embargo, la naturaleza gravemente debilitante de patologías NV basado corneales, la escasez de instalaciones quirúrgicas capaces de tratar NV corneal, y la falta de una opción farmacológica encarecidamente realizar encabezó una mesa redonda de expertos reciente a la conclusión de que, a pesar de las terapias existentes, la necesidad médica fundamental presentado por estas patologías permanece insatisfecha 4.
La córnea humanaconsta de 5 capas, 3 capas celulares (epitelial, del estroma y el endotelio) y 2 interfaz (membrana de Bowman y la membrana de Descemet). Funciona como una barrera mecánica y la superficie de refracción para el ojo. Su naturaleza transparente es la consecuencia de un delicado equilibrio de sus componentes, y es parte integral de su función adecuada 5. Normalmente avascular, la córnea recibe sangre de microvasos que se ejecutan a lo largo de su borde exterior que se alimenta desde la ciliar y las arterias oftálmicas. Corneal NV se produce cuando un estímulo promueve la angiogénesis de estos vasos permitiendo que crezcan hacia el centro de la córnea y por lo tanto limitar la visión 6. Angiogénesis corneal incluye hemangiogenesis y linfangiogénesis, que resultan en el crecimiento hacia el interior de los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos de la arcada vascular del limbo hacia el centro de la córnea. Esto conduce a un desglose de la córnea "privilegio angiogénico", un aumento en la opacidad de la córnea y la fibrosis, la alteración de la córnea Layers, y edema 7. Los disparadores precisos de NV corneal son numerosos, que van desde una respuesta a las enfermedades infecciosas como el tracoma en un estado inducido químicamente causado medicinas tradicionales, productos químicos industriales, o incluso agentes de guerra química.
Los mecanismos moleculares de este proceso no son, por ahora, completamente caracterizados; sin embargo, se han identificado algunos jugadores clave. En condiciones normales la córnea posee un 'privilegio angiogénico' única mantenida por una matriz redundante de factores anti-angiogénicos (tales como solubles de VEGF-R1) 8. Sin embargo, en respuesta a un estímulo externo (tal como una lesión), habrá una regulación por incremento local de factores pro-angiogénicos (por ejemplo, VEGF-A). Esto inclina la balanza de factores pro y anti-angiogénicos que subyace privilegio angiogénico de la córnea, y conduce a hemangiogenesis, lymphangeogenesis, y la inflamación, por lo tanto, causando la patología de la córnea e incluso ceguera 9.
<p class = "jove_content"> Debido a la necesidad médica no satisfecha de esta patología altamente debilitante, es de interés para el campo para tener un modelo animal fiable de NV corneal. Aquí se presenta un modelo de este tipo: control de lesiones álcalis quemadura. Se han utilizado diversos modelos de ojo de lesiones basado en el uso de anillos de papel de filtro desde 1970 10. En 1989, un grupo de oftalmólogos Escuela de Medicina de Harvard caracteriza un modelo estándar de una lesión alcalino-quemadura de la córnea central en conejo basado en remojo un pedazo de papel de filtro circular con hidróxido de sodio (NaOH) y su aplicación a la córnea en un rango específico de concentraciones 11. Desde entonces, esta técnica se ha adaptado para su uso en el 12-14 ratón. Recientemente, el laboratorio de Wang estudió los efectos terapéuticos de la histona deacetilasa (HDAC) inhibidor de SAHA en la patogénesis de NV de la córnea utilizando un modelo de lesión de la córnea del ratón alcalino-quemadura 15. La metodología del modelo de lesión de la córnea del ratón alcalino-quemadura presentado aquí fue construidoprincipalmente en el trabajo previo de otros dos trabajos 14,16.Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo que se presenta aquí se traduce en niveles reproducibles de hemangiogenesis, LI, y la inflamación, por lo que es un sistema ideal para estudiar estos tres procesos (interrelacionados). Mientras que este método produce centralizado NV córnea, varios métodos que se han desarrollado para causar más dirigida NV, a saber, la sutura de la córnea 17 y implantados factor de crecimiento expresando gránulos 18, también puede ser de interés. Nuestro protocolo está diseñado para su uso…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos por la ayuda del Dr. Li Xinyu en la preparación del manuscrito. SW fue apoyada por un fondo de inicio de la Universidad de Tulane, Consejo de Investigación Premio al Investigador Nuevo del presidente de UT Southwestern Medical Center, NIH subvención EY021862, un premio de desarrollo de la carrera de la Investigación para Prevención de fundación ceguera, y un Premio Brillante Foco en la edad degeneración macular asociada a la Investigación .
Materials
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 18 Guage Needle | BD | 305918 | |
| 10 mL Syringe | BD | 306575 | |
| 25 Guage Needle | BD | 305916 | |
| Anti-F4/80 (rat anti-mouse) | AbD Serotech | MCA497RT | |
| Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse) | Abcam | ab14917 | |
| Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse) | BD | 553370 | |
| Anti-IgG Alexa488 (goat anti-rat) | Invitrogen | A11006 | |
| Anti-IgG Alexa594 (goat anti-rabbit) | Invitrogen | A11012 | |
| Camera | Tucsen | TCC 5.0 ICE | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DMSO | Sigma | D4540-1L | Caution: Mutagenic, Toxic |
| Forceps (Blunt), Iris | WPI | 15915 | |
| Forceps (Sharp), Dumont #4 | WPI | 500340 | |
| KCl | Fisher | P217-500 | |
| Ketamine Solution | MedVet | RXKETAMINE | Controlled substance, proper license required for use. |
| Light Source for Microscope | AmScope | LED-14M-YA | |
| Microscope (Stereo 7X-45X) | AmScope | SM-1B | |
| Mounting Medium, Vectashield | Vector | H-1000 | |
| NaCl | Fisher | S271-10 | |
| NaH2PO4 | Fisher | S397-500 | |
| NaOH | Fisher | S318-1 | Caution: Corrosive |
| Paraformaldehyde | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic | |
| Proparacaine Hydrochloride | Sigma | P4554-1G | |
| Scissors (5mm blade), Vanas | WPI | 14003 | |
| Goat Serum | MPBio | 92939249 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-6508 | |
| Xylazine Solution | MedVet | RXANASED-20 |
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