Analyse de la traduction Initiation Pendant conditions de stress par polysome profilage
Summary
Ici, nous décrivons une méthode pour analyser l'évolution de l'initiation de la traduction de l'ARNm de cellules eucaryotes en réponse à des conditions de stress. Cette méthode est basée sur la séparation de vitesse sur des gradients de saccharose de la traduction à partir de ribosomes ribosomes non translating.
Abstract
Un contrôle précis de la traduction des ARNm est fondamentale pour l'homéostasie des cellules eucaryotes, en particulier en réponse à un stress physiologique et pathologique. Des modifications de ce programme peuvent conduire à la croissance des cellules endommagées, une caractéristique de développement de cancer, ou à une mort cellulaire prématurée tel que vu dans les maladies neurodégénératives. Une grande partie de ce qui est connu au sujet de la base moléculaire pour la commande de translation a été obtenue à partir de polysomes analyse en utilisant un système de fractionnement à gradient de densité. Cette technique repose sur des extraits cytoplasmiques ultracentrifugation sur un gradient de saccharose linéaire. Une fois l'essorage est terminé, le système permet le fractionnement et la quantification des zones correspondant à la traduction centrifugés ribosomes populations différentes, conduisant ainsi à un profil de polysomes. Les changements dans le profil de polysomes sont indicatifs de changements ou de défauts dans l'initiation de traduction qui se produisent en réponse à différents types de stress. Cette technique permet également d'évaluer èmee rôle des protéines spécifiques sur initiation de la traduction, et pour mesurer l'activité de traduction des ARNm spécifiques. Nous décrivons ici notre protocole pour effectuer des profils de polysomes, afin d'évaluer l'initiation de traduction de cellules eucaryotes et des tissus dans des conditions de croissance normales, ou soit contrainte.
Introduction
Les cellules eucaryotes rencontrent constamment une gamme de conditions de stress physiologiques et environnementaux néfastes qui nécessitent une réponse cellulaire adaptative rapide. réponse au stress cellulaire implique un équilibre précis entre anti-survie et pro-survie facteurs agissant. Perturber cet équilibre peut avoir des conséquences irréversibles menant au développement de pathologies humaines telles que le cancer et les maladies neurodégénératives. Au cours de la première étape de la réaction de stress, les cellules activent des voies pro-survie qui comportent la commande coordonnée des changements dans l'expression génétique au niveau de la traduction de l'ARNm.
traduction de l'ARNm chez les eucaryotes est un processus cellulaire complexe qui implique des interactions coordonnées entre les facteurs d'initiation de traduction (SIFE), des protéines de liaison d'ARN spécifique (RBD), et des molécules d'ARN 1. traduction de l'ARNm est divisé en trois phases distinctes: initiation, l'élongation et terminaison. Bien que les trois phases sont soumis à réglemécanismes mentaires, les mécanismes de contrôle de la traduction ciblent principalement la phase d'initiation de la traduction, qui constitue ainsi l'étape de limitation de vitesse de la synthèse des protéines 2.
initiation de la traduction est un processus hautement ordonnée qui commence avec la formation de la eIF2a.GTP.Met-ARNt i Met complexe ternaire et sa liaison ultérieure de la sous-unité 40S du ribosome, ce qui conduit à la formation du complexe de pré-initiation. La prochaine étape est le recrutement du complexe de pré-initiation à l'ARNm, ce qui implique l'activité des facteurs d'initiation de traduction tels que eIF4F et eIF3. Le complexe de pré-initiation 48S ainsi formé subit des changements conformationnels spécifiques qui permettent cette machinerie pour commencer la numérisation de la région 5 'non traduite de l'ARNm jusqu'à ce qu'il reconnaît le codon d'initiation août La plupart des facteurs d'initiation de traduction sont alors libérés et sous-unités 60S sont recrutés pour former un ribosome 80S complexe compétente pour la traduction, unt qui la synthèse des protéines point commence (Figure 1). Plus d'un 80S monosome peut être la traduction de l'ARNm même à un moment la production de soi-disant polysomes (ou polyribosomes). La densité des polysomes sur un ARNm reflète l'initiation, l'élongation et les tarifs de terminaison et est une mesure de la transcription d'un Traduisibilité particulier ainsi. Cependant, polysome profil est principalement utilisé pour évaluer les changements dans la traduction de l'ARNm à l'étape d'initiation. Ici, nous avons utilisé un inhibiteur de protéasome comme inhibiteur d'initiation de traduction. Le traitement des cellules cancéreuses avec ce médicament induit une réponse au stress caractérisé par l'activation de la kinase de stress nommé HRI qui phosphoryle le facteur d'initiation de traduction eIF2a 3. La phosphorylation de eIF2a est l'un des principaux événements qui ont conduit à l'inhibition de l'initiation de la traduction dans les cellules de mammifères 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'analyse de profils de polysomes sur des gradients de saccharose permet la mesure de l'initiation de traduction en analysant la densité de polysomes isolés à partir de cellules ou de tissus 9,11-14. Cette technique est la meilleure (si ce n'est pas l'Unique) approche pour mesurer initiation de la traduction in vivo. Il est utilisé pour surveiller l'état de translation de la croissance de cellules au cours du cycle cellulaire 15, et à évaluer les effets de diffé…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PA est récipiendaire d'une bourse «Pierre Durand» de la Faculté de médecine de l'Université Laval. Ce travail a été soutenu par le Conseil de recherches en génie du Canada (MOP-CG095386) en sciences naturelles et de RM Le fractionnement de polysome a été acquis par une Fondation canadienne pour l'octroi de l'innovation (MOP-GF091050) à RMR M est titulaire d'une bourse de nouveau chercheur des salaires des IRSC.
Nous sommes reconnaissants à MM. E. Khandjian, I. Gallouzi, S. Di-Marco et A. Cammas pour obtenir des conseils utiles.
Materials
| Cells | ||||
| HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | ||
| Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | ||
| Culture medium and Supplements | ||||
| Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | ||
| DMEM | Life technologies | 11995-073 | ||
| FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | ||
| penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | ||
| Sucrose solutions | ||||
| D-Sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | ||
| Blue Bromophenol | Fisher Scientist | B3925 | ||
| Lysis buffer | ||||
| Tris Hydrochloride | Fisher Scientist | BP153-500 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | ||
| NaCl | Tekniscience | 3624-05 | ||
| DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | ||
| Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | ||
| SDS | Tekniscience | 4095-02 | ||
| RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | ||
| Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | ||
| RNA Extraction | ||||
| Proteinase K | Life technologies | AM2542 | ||
| Phenol: Chloroforme | Fisher Scientist | BP1754I-400 | ||
| Chloroforme | Fisher Scientist | C298-500 | ||
| Glycogen | Life technologies | 10814-010 | ||
| Isopropanol | Acros organics | 327270010 | ||
| Antibodies | ||||
| anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | |||
| anti-Ribosomal Protein L28 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-50362 | ||
| Others | ||||
| Proteasome inhibitor : Bortezomib | LC Laboratories | B-1408 | ||
| DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D5758-25ml | ||
| RNaseZAP Solution | Life technologies | AM9780 | ||
| Materials | ||||
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | ||
| 1cc U100 Insulin Syringe 28 G1/2 | Fisher Scientist | 148291B | ||
| Tube ultra-centrifugation, PA, 12ml | Fisher Scientist | FSSP9763205 | ||
| Isco Model 160 gradient former | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| Ultracentrifuge Sorvall OTD Combi | ||||
| Thermo Scientific Sorvall Rotor TH-641 | Thermo scientific | 54295 | ||
| Automated Density Fractionation System | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | 67-9000-177 | ||
| Isco UA-6 UV-vis detector | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | |||
| Ultracentrifuge C 5415 | Eppendorf | |||
| Optical Microscope | Olympus CK2 | |||
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