Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi
Summary
Burada, stres koşullarında tepki olarak ökaryotik hücrelerin mRNA çevirisi başlatılmasında değişiklikleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem olmayan çeviri ribozom ribozomlan çeviri sakaroz Yokuşta hız ayrılık dayanmaktadır.
Abstract
MRNA çevirisi hassas kontrolü, özellikle fizyolojik ve patolojik strese yanıt olarak, ökaryotik hücre homeostazı için temeldir. Bu programın değişiklikler kanser gelişimi arasında ayırt edici bir özelliği, ya da nörodejeneratif hastalıklarda görüldüğü gibi, prematüre hücre ölümüne hasarlı hücrelerin büyümesine yol açabilir. Translasyonel kontrol için moleküler temel ilişkin bilinenlerin çoğu bir yoğunluk gradyan ayırma sistemi kullanılarak Polizom analizinden elde edilmiştir. Bu teknik, bir doğrusal sakroz gradyanı üzerinde sitoplazmik özler ultrasantrifüj dayanır. Sıkma işlemi tamamlandıktan sonra, sistem, farklı çeviri tekabül eden santrifüj bölgelerinin ayırma ve böylece bir miktar Polizom profili ile sonuçlanan popülasyonları ribozom sağlar. Polisom profilde değişiklikler stres çeşitli tepki olarak meydana gelen çeviri başlatma değişiklikler veya kusurların göstergesidir. Bu teknik aynı zamanda inci değerlendirmek sağlar:e çeviri başlatma belirli proteinlerin rolü ve spesifik mRNA translasyon aktivitesini ölçmek için. Burada, normal ya da stres ya da büyüme koşulları altında, ökaryotik hücrelerin ve dokuların başlatılması için değerlendirmek amacıyla Polizom profilleri gerçekleştirmek için protokol açıklar.
Introduction
Ökaryotik hücreler sürekli bir hızlı adaptif hücre yanıtı gerektiren zararlı fizyolojik ve çevresel stres koşulları bir dizi karşılaşma. Hücre stres yanıtı, anti-hayatta kalma ve pro-sağkalım etkili faktörler arasındaki hassas denge içerir. Bu dengeyi bozarak kanser ve nörodejeneratif hastalıklar gibi insan patolojilerin gelişimine öncülük geri dönülmez sonuçlar doğurabilir. Stres yanıtı ilk adımı sırasında, hücreler mRNA çeviri düzeyinde gen ekspresyonunda değişiklikler koordine kontrolü ile ilgili pro-hayatta kalma yolunu aktive edebilir.
ökaryotlarda mRNA çevirisi başlatma faktörleri (EIFS), spesifik RNA bağlayıcı protein (RBDS) ve RNA molekülleri 1 ila koordineli etkileşimleri içeren karmaşık hücresel bir süreçtir. başlatma, uzama ve sonlanma: mRNA çeviri üç ayrı evreye ayrılır. Her üç faz dede tabi olsa da,translasyonel kontrol mekanizmaları, böylece protein sentezi 2'nin oran-sınırlayıcı bir adım teşkil etmektedir çeviri çoğunlukla başlangıç aşaması, hedef merciin düzenleyici mekanizmalar,.
Çeviri başlatma i ön başlatma kompleksinin oluşumuna yol açan, üçlü kompleks ve 40S ribozom alt birimine yönelik daha sonraki bağlanma Met eIF2a.GTP.Met-tRNA oluşumu ile başlayan bir çok düzenli bir süreçtir. Bir sonraki adım, eIF4F ve eIF3 gibi çeviri başlatma faktörlerinin aktivitesi içerir mRNA için preinitiation kompleksinin işe olan. Bu şekilde oluşturulan 48S preinitiation kompleksi AUG başlangıç kodonunun tanıyıncaya kadar mRNA'nın 5'-ötelenmemiş bölge tarama başlatmak için bu makine sağlayacak özel yapısal değişikliklere uğrar. Çeviri başlangıç faktörlerin çoğu daha sonra serbest bırakılır ve 60S alt birimleri bir 80S oluşturmak için işe alınırlar ribozom kompleksi çeviri, yetkili birt hangi nokta protein sentezi başlar (Şekil 1). Birden fazla 80S monosome sözde polisomlann (veya poliribozomların) üreten bir zamanda aynı mRNA'nın tercüme edilebilir. Bir mRNA üzerinde polizom yoğunluğu başlatma, sonlandırma ve uzama oranları yansıtır ve böylece, belirli bir transkriptin çevrilebilirlik bir ölçüsüdür. Bununla birlikte, polisom profili esas olarak başlangıç aşamasında mRNA çevirisinde değişiklikleri değerlendirmek için kullanılır. Burada çeviri başlatma inhibitörü gibi bir proteazom önleyicisi kullandık. Bu ilaç kanser hücrelerinin tedavisi translasyon başlatma faktörü eIF2a 3 fosforile HRI adlı stres kinazın aktivasyonu ile karakterize edilen bir stres tepkisi oluşturur. EIF2a fosforilasyonu, memeli hücrelerinde 4 çeviri başlatma inhibisyonuna yol açan önemli olaylardan biridir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sukroz dereceleri üzerinde Polizom profil analizi hücreler ya da dokulardan 9,11-14 izole polizom yoğunluğu analiz ederek çeviri başlangıç ölçümünü sağlar. Bu teknik, en iyi yaklaşım (değil benzersiz ise) in vivo çeviri inisiyasyon ölçmek için. Bu, hücre döngüsü boyunca 15 hücrelerinin büyüyen translasyonel durumunu izlemek için ve çeviri başlatma üzerinde, viral enfeksiyonlar, hipoksi 13,16, radyasyon 17 ve kimyasal ilaçlar tera…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PA Laval Üniversitesi Tıp Fakültesi bursu "Pierre Durand" bir alıcı. Bu çalışma Polizom parçalama RMR M yeni CIHR araştırmacı maaş ödülü tutar için inovasyon hibe Kanadalı Vakfı (MOP-GF091050) yoluyla elde edilmiş RM Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi (MOP-CG095386) tarafından desteklenmiştir.
Biz Dr minnettarız. Yararlı tavsiyeler E. Khancıyan, I. Gallouzi, S. Di-Marco ve A. Cammas.
Materials
| Cells | ||||
| HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | ||
| Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | ||
| Culture medium and Supplements | ||||
| Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | ||
| DMEM | Life technologies | 11995-073 | ||
| FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | ||
| penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | ||
| Sucrose solutions | ||||
| D-Sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | ||
| Blue Bromophenol | Fisher Scientist | B3925 | ||
| Lysis buffer | ||||
| Tris Hydrochloride | Fisher Scientist | BP153-500 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | ||
| NaCl | Tekniscience | 3624-05 | ||
| DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | ||
| Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | ||
| SDS | Tekniscience | 4095-02 | ||
| RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | ||
| Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | ||
| RNA Extraction | ||||
| Proteinase K | Life technologies | AM2542 | ||
| Phenol: Chloroforme | Fisher Scientist | BP1754I-400 | ||
| Chloroforme | Fisher Scientist | C298-500 | ||
| Glycogen | Life technologies | 10814-010 | ||
| Isopropanol | Acros organics | 327270010 | ||
| Antibodies | ||||
| anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | |||
| anti-Ribosomal Protein L28 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-50362 | ||
| Others | ||||
| Proteasome inhibitor : Bortezomib | LC Laboratories | B-1408 | ||
| DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D5758-25ml | ||
| RNaseZAP Solution | Life technologies | AM9780 | ||
| Materials | ||||
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | ||
| 1cc U100 Insulin Syringe 28 G1/2 | Fisher Scientist | 148291B | ||
| Tube ultra-centrifugation, PA, 12ml | Fisher Scientist | FSSP9763205 | ||
| Isco Model 160 gradient former | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| Ultracentrifuge Sorvall OTD Combi | ||||
| Thermo Scientific Sorvall Rotor TH-641 | Thermo scientific | 54295 | ||
| Automated Density Fractionation System | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | 67-9000-177 | ||
| Isco UA-6 UV-vis detector | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | |||
| Ultracentrifuge C 5415 | Eppendorf | |||
| Optical Microscope | Olympus CK2 | |||
References
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).
- Fournier, M. -. J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell International. 10 (12), (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).
- Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
- Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs. Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).
- Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms. RNA. 15 (10), 1814-1821 (2009).
- Gareau, C., Houssin, E., et al. Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
- Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
- Khandjian, E. W., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).
- Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. Translational control of gene expression in the human brain. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).
- Stephens, S. B., Nicchitta, C. V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum. Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).
- Koritzinsky, M., Wouters, B. G. Hypoxia and regulation of messenger RNA translation. Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).
- Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes. Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).
- Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division. Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).
- Thomas, J. D., Johannes, G. J. Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia. RNA. 13, 1116-1131 (2007).
- Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components. Recherche en cancérologie. 68 (10), 3819-3826 (2008).
- Fournier, M. -. J., Coudert, L., et al. Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).
- Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator. Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).
- Béchade, C., Rostaing, P., et al. Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport. The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).
- Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules. Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).
- Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).
- Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association. BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).
- Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
- Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Morris, D. R. Ribosomal footprints on a transcriptome landscape. Genome Biology. 10 (4), (2009).
