यहाँ, हम स्थितियां तनाव के जवाब में कोशिकाओं की mRNA अनुवाद की दीक्षा में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन. इस विधि गैर अनुवाद राइबोसोम से राइबोसोम का अनुवाद करने में सुक्रोज ढ़ाल पर वेग जुदाई पर आधारित है.
MRNA अनुवाद के सटीक नियंत्रण विशेष रूप से शारीरिक और रोग तनाव के जवाब में, यूकेरियोटिक सेल homeostasis के लिए मौलिक है. इस कार्यक्रम के बदलाव कैंसर के विकास की एक बानगी, या ऐसे neurodegenerative रोगों के रूप में देखा समयपूर्व कोशिका मृत्यु को क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. Translational नियंत्रण के लिए आणविक आधार के विषय में जाना जाता है की ज्यादातर एक घनत्व ढाल fractionation प्रणाली का उपयोग कर polysome विश्लेषण से प्राप्त किया गया है. इस तकनीक को एक रैखिक sucrose ढाल पर cytoplasmic अर्क के ultracentrifugation पर निर्भर करता है. स्पिन के पूरा होने पर, सिस्टम अलग अनुवाद करने के लिए इसी centrifuged क्षेत्रों का विभाजन और मात्रा का ठहराव इस प्रकार एक polysome प्रोफाइल में जिसके परिणामस्वरूप, आबादी राइबोसोम की अनुमति देता है. Polysome प्रोफ़ाइल में परिवर्तन तनाव के विभिन्न प्रकार के जवाब में होते हैं कि अनुवाद दीक्षा में परिवर्तन या दोष का संकेत कर रहे हैं. इस तकनीक को भी वें आकलन करने के लिए अनुमति देता हैई अनुवाद दीक्षा पर विशेष प्रोटीन की भूमिका, और विशिष्ट mRNAs का translational गतिविधि को मापने के लिए. यहाँ हम सामान्य या तनाव या तो विकास शर्तों के तहत कोशिकाओं और ऊतकों का अनुवाद दीक्षा का आकलन करने के क्रम में polysome प्रोफाइल के प्रदर्शन करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन.
कोशिकाओं को लगातार एक तेजी से अनुकूली सेल प्रतिक्रिया की आवश्यकता है कि हानिकारक शारीरिक और पर्यावरण के तनाव की स्थिति की एक श्रृंखला का सामना. सेल तनाव प्रतिक्रिया विरोधी अस्तित्व और समर्थक अस्तित्व अभिनय कारकों के बीच एक सटीक संतुलन शामिल है. इस संतुलन में खलल न डालें इस तरह के कैंसर और neurodegenerative रोगों के रूप में मानव विकृतियों के विकास में अग्रणी अपरिवर्तनीय परिणाम हो सकते हैं. तनाव की प्रतिक्रिया के पहले चरण के दौरान, कोशिकाओं mRNA अनुवाद के स्तर पर जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के समन्वित नियंत्रण शामिल है कि समर्थक अस्तित्व के रास्ते को सक्रिय करें.
eukaryotes में mRNA अनुवाद अनुवाद दीक्षा कारक (EIFS), विशिष्ट शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन (RBDs), और शाही सेना अणु 1 के बीच समन्वित बातचीत शामिल है कि एक जटिल सेलुलर प्रक्रिया है. दीक्षा, बढ़ाव, और समापन: mRNA अनुवाद तीन अलग चरणों में बांटा गया है. सभी तीन चरणों नियमित यद्यपिtranslational नियंत्रण तंत्र इस प्रकार प्रोटीन संश्लेषण 2 की दर सीमित कदम का गठन किया जो अनुवाद के ज्यादातर दीक्षा चरण लक्षित latory तंत्र.
अनुवाद दीक्षा मैं पूर्व दीक्षा परिसर के गठन के लिए अग्रणी, त्रिगुट जटिल और 40 राइबोसोम सबयूनिट के लिए इसके बाद के बंधन मेट eIF2a.GTP.Met-tRNA के गठन के साथ शुरू होता है कि एक उच्च आदेश दिया प्रक्रिया है. अगले कदम के लिए eIF4F और eIF3 के रूप में अनुवाद दीक्षा कारकों की गतिविधि शामिल है mRNA, जो करने के लिए preinitiation परिसर की भर्ती है. इस प्रकार का गठन 48S preinitiation जटिल यह अगस्त कोडोन दीक्षा पहचानता तक mRNA की 5'-untranslated क्षेत्र स्कैनिंग शुरू करने के लिए इस तंत्र को सक्षम है कि विशिष्ट गठनात्मक परिवर्तन आए. अनुवाद दीक्षा कारकों में से अधिकांश तो जारी कर रहे हैं और 60 सब यूनिटों एक 80 फार्म को भर्ती कर रहे हैं राइबोसोम जटिल अनुवाद, के लिए सक्षम एकटी जो बिंदु प्रोटीन संश्लेषण शुरू होता है (चित्रा 1). अधिक एक 80S से monosome तथाकथित polysomes (या polyribosomes) के उत्पादन के लिए एक समय में एक ही mRNA अनुवाद किया जा सकता है. एक mRNA पर polysomes का घनत्व दीक्षा, बढ़ाव और समाप्ति दरों को दर्शाता है और इस प्रकार एक विशेष प्रतिलेख के translatability का एक उपाय है. हालांकि, polysome प्रोफाइल मुख्य रूप से दीक्षा कदम पर mRNA के अनुवाद में परिवर्तन का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यहाँ हम अनुवाद दीक्षा अवरोध करनेवाला के रूप में एक एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला का इस्तेमाल किया है. इस दवा के साथ कैंसर की कोशिकाओं के उपचार अनुवाद दीक्षा कारक eIF2a 3 phosphorylates जो HRI नामित तनाव kinase के सक्रियण द्वारा विशेषता तनाव प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है. EIF2a की phosphorylation स्तनधारी कोशिकाओं 4 में अनुवाद दीक्षा का निषेध करने के लिए अग्रणी प्रमुख घटनाओं में से एक है.
सुक्रोज ढ़ाल पर polysome प्रोफाइल विश्लेषण कोशिकाओं या ऊतकों 9,11-14 से अलग polysomes के घनत्व का विश्लेषण करके अनुवाद दीक्षा की माप की अनुमति देता है. इस तकनीक को सबसे अच्छा है दृष्टिकोण नहीं है (अनूठा अगर) विवो ?…
The authors have nothing to disclose.
पीए Laval विश्वविद्यालय के मेडिसिन के संकाय से एक छात्रवृत्ति "पियरे डूरंड" के एक प्राप्तकर्ता है. इस काम polysome fractionator RMR एम एक नया CIHR अन्वेषक वेतन पुरस्कार धारण करने के लिए नवाचार के अनुदान के लिए एक कनाडाई फाउंडेशन (एमओपी GF091050) के माध्यम से हासिल किया गया था आरएम प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल (एमओपी CG095386) द्वारा समर्थित किया गया.
हम डीआरएस के लिए आभारी हैं. उपयोगी सलाह के लिए ई. Khandjian, मैं Gallouzi, एस डी-मार्को और ए Cammas.
Cells | ||||
HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | ||
Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | ||
Culture medium and Supplements | ||||
Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | ||
DMEM | Life technologies | 11995-073 | ||
FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | ||
penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | ||
Sucrose solutions | ||||
D-Sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | ||
Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | ||
Blue Bromophenol | Fisher Scientist | B3925 | ||
Lysis buffer | ||||
Tris Hydrochloride | Fisher Scientist | BP153-500 | ||
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | ||
NaCl | Tekniscience | 3624-05 | ||
DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | ||
Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | ||
SDS | Tekniscience | 4095-02 | ||
RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | ||
Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | ||
RNA Extraction | ||||
Proteinase K | Life technologies | AM2542 | ||
Phenol: Chloroforme | Fisher Scientist | BP1754I-400 | ||
Chloroforme | Fisher Scientist | C298-500 | ||
Glycogen | Life technologies | 10814-010 | ||
Isopropanol | Acros organics | 327270010 | ||
Antibodies | ||||
anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | |||
anti-Ribosomal Protein L28 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-50362 | ||
Others | ||||
Proteasome inhibitor : Bortezomib | LC Laboratories | B-1408 | ||
DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D5758-25ml | ||
RNaseZAP Solution | Life technologies | AM9780 | ||
Materials | ||||
T25 cell culture flask | Corning | 430639 | ||
1cc U100 Insulin Syringe 28 G1/2 | Fisher Scientist | 148291B | ||
Tube ultra-centrifugation, PA, 12ml | Fisher Scientist | FSSP9763205 | ||
Isco Model 160 gradient former | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
Ultracentrifuge Sorvall OTD Combi | ||||
Thermo Scientific Sorvall Rotor TH-641 | Thermo scientific | 54295 | ||
Automated Density Fractionation System | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | 67-9000-177 | ||
Isco UA-6 UV-vis detector | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | |||
Ultracentrifuge C 5415 | Eppendorf | |||
Optical Microscope | Olympus CK2 |