Isolierung und Quantifizierung von Botulinum Neurotoxin aus komplexen Matrices Mit den Botest Matrix Assays

Summary

Die Botest Matrix Botulinum-Neurotoxin (BoNT) Nachweisassays schnell zu reinigen und zu quantifizieren BoNT aus einer Reihe von Probenmatrix. Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Nachweis und die Quantifizierung von BoNT sowohl aus festen und flüssigen Matrices und zeigen die Assay mit BOTOX, Tomaten und Milch.

Abstract

Für Pharma-, Umwelt-, und Lebensmittelstichproben ist eine genaue Erfassung und Quantifizierung von Botulinum-Neurotoxin (BoNT) in komplexen Matrices erforderlich. Schnelle Prüfung von BoNT Lebensmittel während Ausbruch Forensik, Patientendiagnose und die Lebensmittelsicherheit Tests erforderlich, während genaue Wirksamkeitsprüfung ist für BoNT-basierten Wirkstoffproduktherstellung und die Sicherheit der Patienten erforderlich. Die weit verbreitete Maus-Bioassay für BoNT-Tests ist sehr empfindlich aber es fehlt die Präzision und Durchsatz für schnelle und Routine BoNT Tests erforderlich. Darüber hinaus hat die Verwendung von Tieren in der Bioassay Anrufe Medikament Regulierungsbehörden und Tierschutz Befürworter in den USA und im Ausland, um den Maus-Bioassay für BoNT Versuche ersetzen geführt. Mehrere in vitro-Assays Ersatz entwickelt worden, die gut mit gereinigtem BoNT in einfachen Puffern zu arbeiten, aber die meisten haben nicht gezeigt, für Tests in hoch komplexen Matrices zu sein. Hier wird ein Protokoll zum Nachweis vonBoNT in komplexen Matrices mit den Botest Matrix-Tests vorgestellt. Der Test besteht aus drei Teilen: Der erste Teil beinhaltet die Herstellung der Proben für die Prüfung, ist der zweite Teil eine Immunpräzipitation Schritt mit Anti-BoNT Antikörper-beschichteten paramagnetischen Kügelchen zu BoNT aus der Matrix zu reinigen, und der dritte Teil quantifiziert des isolierten BoNT des proteolytischen Aktivität unter Verwendung eines fluorogenen Reporter. Das Protokoll wird für die Hochdurchsatz-Tests in 96-Well-Platten mit flüssigen und festen Matrizen geschrieben und benötigt ca. 2 h manuelle Vorbereitung mit Gesamttestzeiten von 4-26 h je nach Probentyp, Toxin Last und gewünschte Empfindlichkeit. Daten für BoNT / A-Tests mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, einem Medikament, Kulturüberstand, 2% Milch und frischen Tomaten dargestellt und umfasst Erörterung kritischer Parameter für den Test erfolgreich.

Introduction

Botulinum-Neurotoxine (BoNT) sind die tödlichsten Stoffe bekannt, mit intravenöser Menschen bei 1-3 ng geschätzte letale Dosen / kg ^1,2. Sieben strukturell ähnlichen Serotypen von BoNT, die mit A bis G bestehen, die jeweils aus einer schweren Kette Domäne für Zellbindung, Aufnahme und Translokation in das Cytosol und eine leichte Kette, die eine Zink-Endopeptidase ^05.03 kodiert verantwortlich. Die exquisite Toxizität der BoNT ergibt sich aus, zum Teil, seine spezifische Bindung und Aufnahme in die Motor-Neuronen an der neuromuskulären Endplatte ^6. Einmal im Inneren des Neurons, die leichte Kette Endopeptidase spaltet spezifisch eine oder mehrere der löslichen N-Ethylmaleimid-sensitiver Faktor Attachment-Protein-Rezeptor (SNARE) Proteine, die für Vesikelfusion erforderlich, die Hemmung der Freisetzung von Neurotransmittern und führt zu schlaffer Lähmung ^14.07. Allgemein bekannt als die Krankheit "Botulismus" Lähmung der Membran und Rippenmuskeln durch BoNT bekannten führt letztendlichAtemversagen und Tod, es sei denn eine frühzeitige Diagnose und Behandlung erhalten.

Menschenlebensmittelbedingten Botulismus wird am häufigsten mit BoNT-Serotypen A, B, E verbunden sind, und F (BoNT / A, BoNT / B, etc.) und in der Regel ergibt sich aus der Einnahme von kontaminierten Lebensmitteln ^15,16, obwohl, mehrere Fälle von Wundbotulismus wurden unter intravenös Drogen ^17,18 wiesen. In den Vereinigten Staaten, ist Säuglingsbotulismus von der Einnahme von Clostridium-Sporen durch Kinder unter dem Alter von einem daraus resultierenden die häufigste Form des Botulismus ^19-21. Allerdings wurden lebensmittelbedingten Ausbrüche von BoNT unsachgemäße Einmachen und Lebensmittelverarbeitung resultierenden sowohl in den Vereinigten Staaten und im Ausland berichtet. Zwischen 2000-2009 wurden mindestens 338 Fälle von lebensmittelbedingten Botulismus weltweit, darunter sechs Todesfälle ²² berichtet. Die Fähigkeit zu lebensmittelbedingten Botulismus Ausbrüche rasch und sensibel zu erfassen ist ein entscheidender Hinweis darauf, dass eine frühe Diagnose helfen könnte ^23,24. Darüber hinaus werden Nachweismethoden, die kostengünstig und Routinelebensmitteltests ermöglichen eine verbesserte Ernährungssicherheit führen.

BoNT des neuronalen Spezifität und langen biologischen Halbwertszeit macht es eine starke therapeutische auch. In den Vereinigten Staaten, sind BoNT-basierte Medikamente, die von der Food and Drug Administration für die Behandlung von kosmetischen Bedingungen und neuromuskuläre bedingten Erkrankungen einschließlich Glabellafalten, zervikale Dystonie, Migräne-Kopfschmerzen, überaktive Blase, und Strabismus genehmigt. Zahlreiche "off-label"-Anwendungen werden dokumentiert, einschließlich der Hochdosis-Behandlungen für schwere Muskelfunktionsstörungen ^25-28. Genaue Toxin Quantifizierung ist entscheidend für die richtige Dosierung, wie Unterdosierung kann zu unwirksame Behandlung führen, während eine Überdosierung bringt Patienten mit einem Risiko von potenziell schädlichen Nebenwirkungen. Leider ist keine standardisierte Potenz Testprotokoll über Hersteller geteilt, was zu Einheit Definition Ungleichheiten zwischen BoNT-basierten Wirkstoff products ^29-31.

Der Standardtest für BoNT ist der Maus-Bioassay, in der BoNT-haltigen Proben werden intraperitoneal in Mäuse injiziert und die Zahl der Todesfälle registriert über 1-7 Tage ^16,32,33. Der Maus-Bioassay ist sehr empfindlich mit Nachweisgrenzen (LOD) von 5-10 pg BoNT / A ^34, aber ethische Bedenken über Tierversuche, die hohen Kosten der Ausbildung von Personal und die Aufrechterhaltung Tierhaltung, lange Testzeiten und das Fehlen von standardisierte Protokolle führte Anrufe auf standardisierte, tierversuchsfreie Test BoNT-und Quantifizierungsmethoden ^35-39 zu entwickeln. Kürzlich wurden mehrere alternative BoNT Quantifizierungsmethoden entwickelt, die Maus oder in der Nähe von Maus-Bioassay-Empfindlichkeit ^40-49 bieten. Diese Methoden verwenden häufig Fluoreszenz, Massenspektrometrie, oder immunologische Methoden und bieten Testzeiten deutlich kürzer als der Maus-Bioassay, ohne Tierversuche. Massenspektrometrie-Ansätze mit immunologischen Techniq kombiniertues wurde gezeigt, nachzuweisen und zu quantifizieren BoNT in Lebensmitteln und anderen komplexen Proben enthielten jedoch, Personal Training Anforderungen und Spezialausrüstung Grenze diese Assays ^50-55. Die meisten anderen alternativen Assays sind nicht ohne weiteres auf komplexe Stichproben oder fehlt die Routine für BoNT Prüfung erforderlichen Durchsatz. Die hohe Variabilität der Lebensmittelprobe Viskosität, pH-Wert, Salzgehalt und Matrixbestandteile stellt eine besondere Herausforderung bei dem Versuch, in-vitro-Testverfahren mit einer Empfindlichkeit, die extreme Wirksamkeit von BoNT entsprechen zu entwickeln. Selbst einfache und relativ gutartig Puffersysteme, wie die von Aufwirbelung von BoNT-basierte Arzneimittel entstehen, enthalten Salz, Eiweiß, Zucker und Stabilisatoren (zB Hilfsstoffe), die wesentlichen Einfluss in vitro Wirksamkeit von BoNT ^56. Toxin Reinigung wird für die genaue Prüfung der Wirksamkeit von allen, aber die einfachsten Proben ^56-59 erforderlich.

DieBotest Matrix-Tests wurden für die schnelle Hochdurchsatz ausgelegt und konsistente Quantifizierung von BoNT von sehr komplexen Proben mit Hilfe von Geräten häufig in Forschungslabors ^56,60 gefunden. Diese Assays verwenden paramagnetischen Kügelchen kovalent an Serotyp-spezifischen Anti-BoNT-Antikörper verbunden, zu binden und zu maskieren BoNT von einer Probe und entfernen störende Matrix Verbindungen durch Waschen. Nach dem Waschen wird gebundenen BoNT proteolytischen Aktivität dann in einer optimierten Reaktionspuffer mit einem Reporter mit der BoNT-Serotyp getestet kompatibel quantifiziert. Diese Reporter sind fluorogene Proteine, bestehend aus einem N-terminalen cyan fluoreszierende Protein (GFP)-Komponente und eine C-terminale gelb fluoreszierendes Protein-Derivat (Venus)-Einheit durch ein BoNT Substrat, SNAP25 Reste 141-206 oder Synaptobrevin Reste 33-94 verbunden, die die Botest A / E oder B / D / F / G-Reporter, beziehungsweise ^45. Reporter Spaltung durch BoNT wird mit Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) überwacht. Wenn ter Reporter ist intakt, Anregung von CFP führt FRET zur Venus, Abschrecken CFP-Emission und spannende Venus Emission. Spaltung des Reporters durch BoNT verhindert FRET, was zu einem Anstieg der GFP-Emission und Abnahme der Venus-Emission. BoNT-Aktivität kann dann quantitativ mit dem Verhältnis der GFP und Venus-Emissionen gemessen werden. LOD unter 3 pg sind aus einer breiten Palette von Lebensmitteln mit einem Hochdurchsatz-96-Well-Plattenformat ⁵⁶ möglich. Erhöhte Empfindlichkeit kann durch größere Probenvolumina erzielt werden, da der Test ermöglicht Konzentration des Toxins auf die Oberfläche der Kügelchen.

Die Botest Matrix Assays für BoNT A, B, E und F wurden entwickelt und mit Lebensmittel-, Pharma-und Umweltproben ^56,60 getestet. Hier beschreiben wir Verfahren für die Durchführung dieser Tests für den Nachweis von BoNT bei geringer Komplexität (zB Pharma-, BoNT in Puffer) und hoher Komplexität (zB Lebensmittel-, Umwelt-) Proben. Spezielle Verarbeitungsmethodenmehrere Probentypen werden in diesem Protokoll adressiert und Probentypen hier nicht beschrieben sind, können in der Regel mit einer Kombination der vorgestellten Methoden angepasst werden. Das Protokoll wurde entwickelt und getestet, mit BoNT / A, jedoch ist anpassungsfähig an andere BoNT-Serotypen unter Verwendung ihres jeweiligen Assays wie anderswo ^56,60 demonstriert.

Protocol

1. Vorbereitung der Assay-Reagenzien Tauwetter 200x Dithiothreitol (DTT), 10x Matrix Bindungspuffer (10x Binding Puffer bezeichnet), 10x Neutralisationspuffer (Lebensmittel-oder pH-Ungleichgewicht Proben) und 10x Botest Reaktionspuffer (10x Reaktionspuffer bezeichnet) bei Raumtemperatur (RT) für 15 min oder bis sie vollständig aufgetaut. Siehe Tabelle 1 für eine Liste von Puffern und Reagenzien in diesem Protokoll verwendet. Siehe Tabelle 2 für eine Liste von Materialien …

Representative Results

Ein Diagramm, das die Schritte in der beschriebenen Protokoll ist in Fig. 2 gezeigt. Der Test benötigt zwischen 4-26 Stunden, je nach Probentyp und die gewünschte Testempfindlichkeit zu vervollständigen, aber nur ~ 2 Stunden von Hands-on-Zeit. Der Assay wird in 96-Well-Platten durchgeführt und je nach Art der Prüfung durchgeführt wird, ermöglicht Dreifachprüfung von bis zu 20 Proben einschließlich Standards pro Platte. Fig. 3 zeigt repräsentative T…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Quantifizierung von BoNT / A-Komplex, Holotoxin oder Clostridium Kulturüberstand in komplexen Matrices. Das Protokoll ist das gleiche, jedoch bei der Prüfung anderer BoNT-Serotypen (z. B. BoNT / B, E und F) mit ihren jeweiligen Matrix-Assays ^56,60, obwohl die Empfindlichkeit des Assays werden in Serotypen und Assays variieren. Dieses Protokoll ist nicht für jede Art von Probe möglich Rechnung und je nach der spezifischen Probenzusammensetzung und…

Materials

BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit	BioSentinel	A1015	Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader	Thermo-Fisher Scientific	5250040	Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate	V&P Scientific	VP771H	Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer	BioTek	ELx405 VSRM	Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge	Various	N/A	Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer	Eppendorf	22674200
Orbital Shaker	Various	N/A	Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets	Roche	4693132001	Only required for food or environmental testing.  Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A	Metabiologics	N/A	Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates	NUNC	237105	Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape	Thermo Scientific	15036