BoTest मैट्रिक्स assays का उपयोग जटिल matrices से अलगाव और बोटुलिनम neurotoxin की मात्रा

Summary

BoTest मैट्रिक्स बोटुलिनम neurotoxin (Bont) का पता लगाने assays तेजी से शुद्ध और नमूना matrices की एक सीमा से Bont यों. यहाँ, हम ठोस और तरल दोनों matrices से Bont का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान और बोटोक्स, टमाटर, और दूध के साथ परख प्रदर्शित करता है.

Abstract

सटीक पता लगाने और जटिल matrices में बोटुलिनम neurotoxin (Bont) की मात्रा का ठहराव दवा, पर्यावरण, और खाद्य पदार्थ के नमूने परीक्षण के लिए आवश्यक है. सही शक्ति परीक्षण Bont आधारित दवा उत्पाद विनिर्माण और मरीज की सुरक्षा के लिए आवश्यक है, जबकि खाद्य पदार्थों की रैपिड Bont परीक्षण प्रकोप फोरेंसिक, रोगी निदान, और खाद्य सुरक्षा के परीक्षण के दौरान की जरूरत है. Bont परीक्षण के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल माउस bioassay अत्यधिक संवेदनशील है, लेकिन तेजी से और दिनचर्या Bont परीक्षण के लिए आवश्यक परिशुद्धता और throughput का अभाव है. इसके अलावा, पशुओं के bioassay का उपयोग Bont परीक्षण के लिए माउस bioassay बदलने के लिए अमेरिका में और विदेशों में दवा उत्पाद नियामक अधिकारियों और पशुओं के अधिकारों के समर्थकों द्वारा कॉल में हुई है. कई में इन विट्रो प्रतिस्थापन assays सरल बफ़र्स में शुद्ध Bont के साथ अच्छी तरह से काम करते हैं कि विकसित किया गया है, लेकिन सबसे अत्यधिक जटिल matrices में परीक्षण करने के लिए लागू होने के लिए नहीं दिखाया गया है. इधर, का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉलBoTest मैट्रिक्स assays का उपयोग जटिल matrices में Bont प्रस्तुत किया है. परख तीन हिस्से होते हैं: पहले भाग के परीक्षण के लिए नमूने की तैयारी शामिल है, दूसरे भाग मैट्रिक्स से Bont शुद्ध करने के लिए विरोधी Bont एंटीबॉडी में लिपटे समचुंबक मोती का उपयोग कर एक immunoprecipitation कदम है, और तीसरा हिस्सा अलग Bont के प्रोटियोलिटिक quantifies एक fluorogenic संवाददाता का उपयोग गतिविधि. प्रोटोकॉल तरल और ठोस दोनों matrices का उपयोग 96 अच्छी तरह प्लेटें में उच्च throughput परीक्षण के लिए लिखा है और 4-26 घंटे की कुल परख बार नमूना प्रकार, विष लोड, और वांछित संवेदनशीलता पर निर्भर करता है के साथ मैनुअल तैयार करने के बारे में 2 घंटे की आवश्यकता है. डाटा फॉस्फेट बफर खारा, एक दवा उत्पाद, संस्कृति पर तैरनेवाला, 2% दूध, और ताजा टमाटर के साथ Bont / एक परीक्षण के लिए प्रस्तुत किया है और परख की सफलता के लिए महत्वपूर्ण मापदंडों की चर्चा भी शामिल कर रहे हैं.

Introduction

बोटुलिनम न्यूरोटोक्सिन (BoNTs) 1-3 एनजी का अनुमान नसों में मानव घातक खुराक के साथ ज्ञात घातक पदार्थ, कर रहे हैं / ^1,2 किलो. Bont के सात structurally समान सीरमप्रकारों, प्रत्येक कोशिका एक जस्ता endopeptidase ^3-5 encodes कि cytosol और एक प्रकाश श्रृंखला में, तेज, और स्थानान्तरण बाइंडिंग के लिए जिम्मेदार एक भारी श्रृंखला डोमेन से मिलकर मौजूद हैं, जी के माध्यम से एक लेबल. Bont के उत्तम विषाक्तता भाग में, से परिणाम, neuromuscular जंक्शन ⁶ में मोटर न्यूरॉन्स में अपनी विशिष्ट बाध्यकारी और प्रविष्टि. एक बार न्यूरॉन के अंदर, प्रकाश श्रृंखला endopeptidase विशेष रूप से cleaves घुलनशील एन ethylmaleimide संवेदनशील कारक लगाव प्रोटीन रिसेप्टर (जाल) पुटिका संलयन के लिए आवश्यक प्रोटीन की एक या अधिक, neurotransmitter रिहाई बाधा और झूलता हुआ पक्षाघात ^7-14 के लिए अग्रणी. आमतौर पर बीमारी "बोटुलिज़्म," Bont से डायाफ्राम और पसलियों के बीच मांसपेशियों के पक्षाघात के रूप में जाना जाता है अंततः में परिणामशीघ्र निदान और उपचार जब तक सांस की विफलता और मृत्यु प्राप्त कर रहे हैं.

मानव खाद्य जनित बोटुलिज़्म सबसे अधिक Bont सीरमप्रकारों ए, बी, ई के साथ जुड़े थे, और आमतौर पर एफ (Bont / ए, Bont / बी, आदि) और दूषित खाद्य ^15,16 की घूस का परिणाम है, हालांकि, घाव बोटुलिज़्म के कई मामलों नसों में नशा करने वालों ^17,18 बीच सूचना मिली. संयुक्त राज्य अमेरिका में, एक साल की उम्र के तहत बच्चों द्वारा क्लोस्ट्रीडियम बीजाणुओं की घूस के परिणामस्वरूप शिशु बोटुलिज़्म बोटुलिज़्म ^19-21 का सबसे आम रूप है. हालांकि, अनुचित घर कैनिंग और खाद्य प्रसंस्करण से उत्पन्न खाद्य जनित Bont प्रकोप विदेश में संयुक्त राज्य अमेरिका और दोनों में सूचना मिली. 2000-2009 के बीच, खाद्य जनित बोटुलिज़्म के कम से कम 338 मामलों में छह की ^{मौत, 22} सहित दुनिया भर में सूचना मिली. तेजी से और संवेदनशीलता खाद्य जनित बोटुलिज़्म फैलने का पता लगाने की क्षमता जल्दी निदान में सहायता कर सकता है कि एक महत्वपूर्ण संकेत है ^23,24. इसके अलावा, लागत प्रभावी और नियमित भोजन के परीक्षण की अनुमति है कि पता लगाने के तरीकों में सुधार खाद्य सुरक्षा को बढ़ावा मिलेगा.

Bont के neuronal विशिष्टता और लंबे जैविक आधा जीवन भी यह एक शक्तिशाली चिकित्सकीय बनाता है. संयुक्त राज्य अमेरिका में, Bont आधारित दवाओं कॉस्मेटिक शर्तों और glabellar लाइनों, गर्भाशय ग्रीवा dystonia, माइग्रेन सिर दर्द, अति मूत्राशय, और तिर्यकदृष्टि सहित neuromuscular संबंधी विकारों के इलाज के लिए खाद्य एवं औषधि प्रशासन द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं. कई "बंद लेबल" अनुप्रयोगों गंभीर मांसपेशियों में शिथिलता ^25-28 के लिए उच्च खुराक उपचार सहित, दस्तावेज हैं. Overdosing हानिकारक साइड इफेक्ट के जोखिम में रोगियों डालता है, जबकि underdosing अप्रभावी उपचार के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में सही विष मात्रा का ठहराव, सही खुराक के लिए महत्वपूर्ण है. दुर्भाग्य से, कोई मानकीकृत शक्ति परख प्रोटोकॉल Bont आधारित दवा उत्पादों होगा के बीच इकाई परिभाषा असमानताओं, जिसके परिणामस्वरूप निर्माताओं भर में साझा किया जाता हैसीटीएस ^29-31.

Bont के लिए मानक टेस्ट Bont युक्त नमूने चूहों में intraperitoneally इंजेक्शन और मौतों की संख्या 1-7 दिनों से अधिक ^16,32,33 दर्ज हैं जिसमें माउस bioassay है. माउस bioassay 5-10 पीजी Bont / ए ³⁴ का पता लगाने की सीमा (लोद) के साथ बहुत ही संवेदनशील है, लेकिन, पशु इस्तेमाल को लेकर नैतिक चिंताओं, उच्च प्रशिक्षण कर्मियों की लागत और पशु सुविधाओं, लंबे परख बार, और कमी को बनाए रखने मानकीकृत प्रोटोकॉल मानकीकृत, पशु मुक्त Bont परीक्षण और मात्रा का ठहराव तरीकों ^35-39 विकसित करने के लिए कॉल में हुई. हाल ही में, कई वैकल्पिक Bont मात्रा का ठहराव तरीकों माउस या निकट माउस bioassay संवेदनशीलता ^40-49 प्रस्ताव है कि विकसित किए गए. इन विधियों आमतौर पर प्रतिदीप्ति, जन स्पेक्ट्रोमेट्री, या प्रतिरक्षा विधियों का उपयोग और पशुओं के उपयोग के बिना माउस bioassay की तुलना में काफी कम परख बार प्रदान करते हैं. जन स्पेक्ट्रोमेट्री प्रतिरक्षाविज्ञानी techniq के साथ संयुक्त दृष्टिकोणues का पता लगाने और Bont भोजन और अन्य जटिल नमूने में निहित यों को दिखाया गया है, लेकिन, कर्मियों को प्रशिक्षण आवश्यकताओं और विशेष उपकरणों की सीमा इन assays ^50-55. अधिकांश अन्य वैकल्पिक assays जटिल नमूना परीक्षण के लिए आसानी से लागू नहीं कर रहे हैं या नियमित Bont परीक्षण के लिए आवश्यक throughput की कमी है. Bont की चरम शक्ति मैच के लिए संवेदनशीलता के साथ इन विट्रो परख के तरीकों को विकसित करने की कोशिश कर रहा है जब खाद्य नमूना चिपचिपापन, पीएच, नमक सामग्री, और मैट्रिक्स घटकों के उच्च चर प्रकृति एक विशेष रूप से कठिन चुनौती प्रस्तुत करता है. इसके अलावा, इस तरह के Bont आधारित दवा उत्पादों के मेजबान से उत्पन्न उन के रूप में भी सरल और अपेक्षाकृत सौम्य बफर सिस्टम, काफी इन विट्रो Bont शक्ति ⁵⁶ प्रभाव है कि नमक, albumin, और चीनी स्टेबलाइजर्स (यानी excipients) होते हैं. विष शुद्धि नमूने ^56-59 का सरलतम लेकिन सभी की सटीक गतिविधि के परीक्षण के लिए आवश्यक है.

BoTest मैट्रिक्स assays तेजी, उच्च throughput के लिए तैयार है, और आमतौर पर अनुसंधान प्रयोगशालाओं ^56,60 में पाया उपकरणों का उपयोग अत्यधिक जटिल नमूनों से Bont के अनुरूप मात्रा का ठहराव किया गया. ये assays covalently बाँध और एक नमूना से बाहर Bont एकांत में रहना और फिर धोने से मैट्रिक्स यौगिकों दखल को दूर करने के सीरोटाइप विशेष विरोधी Bont एंटीबॉडी से जुड़ा हुआ समचुंबक मोती का उपयोग करें. धोने के बाद, बाध्य Bont proteolytic गतिविधि तो Bont सीरोटाइप परीक्षण किया जा रहा है के साथ संगत एक संवाददाता का उपयोग कर एक अनुकूलित प्रतिक्रिया बफर में मात्रा निर्धारित है. इन पत्रकारों को एक एन टर्मिनल सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (पी) आधा भाग और गठन एक Bont सब्सट्रेट, SNAP25 अवशेषों 141-206 या synaptobrevin अवशेषों 33-94 से जुड़े एक सी टर्मिनल पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्युत्पन्न (वीनस) आधा भाग से मिलकर fluorogenic प्रोटीन होते हैं BoTest ए / ई या बी / डी / एफ / जी संवाददाताओं से क्रमश: ^45. Bont से रिपोर्टर दरार फोरस्टर प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) का उपयोग करते हुए नजर रखी है. जब टीवह पत्रकार रवांडा की उत्तेजना पाकिस्तानी उत्सर्जन और रोमांचक वीनस उत्सर्जन शमन, वीनस को झल्लाहट में यह परिणाम है, बरकरार है. Bont से रिपोर्टर के विखंडन पाकिस्तानी उत्सर्जन और वीनस उत्सर्जन में कमी में वृद्धि करने के लिए अग्रणी, झल्लाहट से बचाता है. Bont गतिविधि तो मात्रात्मक पाकिस्तानी और वीनस उत्सर्जन का अनुपात का उपयोग करके मापा जा सकता है. 3 पीजी नीचे लोद एक उच्च throughput 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप ⁵⁶ का उपयोग खाद्य पदार्थों की एक विस्तृत श्रृंखला से संभव हो रहे हैं. परख मनका सतह पर विष की एकाग्रता की अनुमति देता है के बाद से वृद्धि की संवेदनशीलता बड़ा नमूना संस्करणों का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है.

BoNTs ए, बी, ई, एफ और के लिए BoTest मैट्रिक्स assays विकसित की है और भोजन, दवा, और पर्यावरण के नमूने ^56,60 के साथ परीक्षण किया गया. यहाँ, हम (जैसे दवा, Bont बफर में) और उच्च जटिलता (जैसे भोजन, पर्यावरण) नमूने कम जटिलता में Bont का पता लगाने के लिए इन assays को क्रियान्वित करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन है. विशिष्ट प्रसंस्करण विधियोंकई नमूना प्रकार इस प्रोटोकॉल में संबोधित कर रहे हैं और यहां वर्णित नहीं नमूना प्रकार के आम तौर पर प्रस्तुत तरीकों का एक संयोजन का उपयोग कर अनुकूलित किया जा सकता है. प्रोटोकॉल विकसित और परीक्षण Bont / ए के साथ, लेकिन कहीं ^56,60 प्रदर्शन के रूप में उनके संबंधित assays का उपयोग अन्य Bont सीरमप्रकारों के लिए अनुकूल हो गया है.

Protocol

1. परख अभिकर्मकों की तैयारी पिघलना 200x dithiothreitol (डीटीटी), 10x मैट्रिक्स बाध्यकारी बफर (10x बाध्यकारी बफर इसके बाद), 10x निराकरण बफर (भोजन या पीएच असंतुलित नमूने केवल), और 15 मिनट के लिए 10x BoTest प्रतिक्रिया बफर कमरे के त?…

Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल में कदम सारांश आरेख चित्रा 2 में दिखाया गया है. परख नमूना प्रकार और वांछित परख संवेदनशीलता के आधार पर पूरा करने के लिए 4-26 घंटे के बीच की आवश्यकता है, लेकिन केवल ~ 2 घंटा समय हाथ पर. पर?…

Discussion

इस प्रोटोकॉल Bont / जटिल matrices में एक जटिल, holotoxin, या क्लोस्ट्रीडियम संस्कृति पर तैरनेवाला बढ़ाता के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन है. परख संवेदनशीलता सीरमप्रकारों और assays भर में अलग अलग होंगे, हालांकि उनके संबंध…

Materials

BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit	BioSentinel	A1015	Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader	Thermo-Fisher Scientific	5250040	Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate	V&P Scientific	VP771H	Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer	BioTek	ELx405 VSRM	Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge	Various	N/A	Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer	Eppendorf	22674200
Orbital Shaker	Various	N/A	Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets	Roche	4693132001	Only required for food or environmental testing.  Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A	Metabiologics	N/A	Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates	NUNC	237105	Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape	Thermo Scientific	15036