Isolering och kvantifiering av botulinneurotoxin Från Komplexa matriser med de BoTest Matrix Analyser

Summary

Den BoTest Matrix botulinum neurotoxin (BoNT) detektionsanalyser snabbt rena och kvantifiera BoNT från en rad olika provmatriser. Här presenterar vi ett protokoll för detektion och kvantifiering av BoNT från både fasta och flytande matriser och visar analysen med Botox, tomater, och mjölk.

Abstract

Det krävs noggrann detektering och kvantifiering av botulinumtoxin (BoNT) i komplexa matriser för läkemedels-, miljö-, och livsmedelsprov testning. Behövs Rapid BoNT testning av livsmedel under utbrottskriminalteknik, patientens diagnos, och livsmedelssäkerhet testning medan exakt potens tester krävs för BoNT-baserade läkemedlet produkttillverkning och patientsäkerhet. Den används flitigt bioassay med möss för BoNT testning är mycket känslig men saknar precision och kapacitet som behövs för snabb och rutin BoNT testning. Dessutom har bioassay användning av djur lett till samtal med läkemedelsprodukt tillsynsmyndigheter och förespråkare djur-rättigheter i USA och utomlands för att ersätta musen bioassay för BoNT testning. Flera in vitro ersättningsanalyser har utvecklats som fungerar bra med renat BoNT i enkla buffertar, men de flesta har inte visat sig gälla för att testa i mycket komplexa matriser. Här, ett protokoll för detektion avBoNT i komplexa matriser med hjälp av BoTest Matrix analyserna presenteras. Analysen består av tre delar: Den första delen handlar om förberedelse av proverna för testning, är den andra delen ett immunoprecipitation steg med hjälp av anti-BoNT antikroppsbelagda paramagnetiska kulor för att rena BoNT från matrisen, och den tredje delen kvantifierar isolerade BoNT s proteolytiska aktivitet med användning av ett fluorogent reporter. Protokollet som är skriven för hög genomströmning testning i 96-brunnars plattor med användning av både flytande och fasta matriser och kräver ca 2 h av manuell beredning med totala analystider 4-26 h beroende på den provtyp, toxin belastning, och önskad känslighet. Data presenteras för BoNT / A-testning med fosfatbuffrad koksaltlösning, en läkemedelsprodukt, odlingssupernatant, 2% mjölk, och färska tomater och inkluderar diskussion av kritiska parametrar för analys framgång.

Introduction

Botulinneurotoxiner (BoNTs) är de dödligaste ämnen som är kända, med intravenösa humana dödliga doser beräknas till 1-3 ng / kg ^1,2. Sju strukturellt liknande serotyper av BoNT, märkta A till och med G, föreligger, var och en bestående av en tung kedja-domänen är ansvarig för cellbindning, upptag och translokering in i cytosolen och en lätt kedja som kodar för ett zink-endopeptidas ^3-5. Den utsökta toxicitet BoNT resultat av delvis dess specifika bindande och träder i motoriska nervceller i den neuromuskulära förbindelsen ^6. Väl inne i neuron, den lätta kedjan endopeptidas specifikt klyver en eller flera av den lösliga N-etylmaleimid-känslig faktor fastsättning proteinreceptor (SNARE) proteiner som krävs för vesikelfusion, hämmande neurotransmittorfrisättning och som leder till förlamning ^7-14. Allmänt känd som sjukdomen "botulism", förlamning av membranet och interkostal muskler av BoNT slutändan resulterar iandningssvikt och död om inte tidig diagnos och behandling mottas.

Human livsmedelsburna botulism är oftast förknippas med BoNT serotyperna A, B, E, och F (BoNT / A, BoNT / B, etc) och oftast resulterar från intag av förorenad mat ^15,16, även om flera fall av sårbotulism rapporterades bland sprutnarkomaner ^17,18. I USA, är spädbarn botulism till följd av intag av Clostridium sporer av barn under ett års ålder den vanligaste formen av botulism ^19-21. Dock var livsmedelsburna BoNT utbrott till följd av felaktig hemkonservering och livsmedelsförädling rapporterats i både USA och utomlands. Mellan 2000-2009 var minst 338 fall av livsmedelsburna botulism rapporterats över hela världen inklusive sex dödsfall ^22. Förmågan att snabbt och känsligt upptäcka livsmedelsburna botulism utbrott är en viktig indikation på att kunna bistå tidig diagnos ^23,24. Dessutom kommer detektionsmetoder som tillåter kostnadseffektiv och rutin mat testning leda till förbättrad livsmedelssäkerhet.

BoNT s neuronal specificitet och lång biologisk halveringstid gör det också en potent terapeutiskt. I USA, är BoNT-baserade läkemedel som godkänts av Food and Drug Administration för behandling av kosmetiska villkor och neuromuskulära relaterade sjukdomar inklusive glabellaveck, cervikal dystoni, migrän, överaktiv blåsa och skelning. Många program "off-label" är dokumenterade, inklusive höga doser behandlingar för svår muskeldysfunktion ^25-28. Exakt toxin kvantifiering är avgörande för korrekt dosering, eftersom underdosering kan leda till ineffektiv behandling medan överdosering sätter patienter med risk för potentiellt skadliga biverkningar. Tyvärr är ingen standardiserad potens analysprotokoll delas mellan tillverkare, vilket resulterar i definitionsenhet ojämlikheter mellan BoNT-baserade läkemedlet produCTS ^29-31.

Den standardtest för BoNT är bioassay med möss där BoNT-innehållande prover injiceras intraperitonealt på möss och antalet dödsfall registrerats under 1-7 dagar ^16,32,33. Musen bioassay är mycket känslig med detektionsgräns (LOD) på 5-10 pg BoNT / A ^34, men etiska oro över djuranvändning, de höga kostnaderna för att utbilda personal och upprätthålla djuranläggningar, långa analystider, och bristen på standardiserade protokoll ledde till samtal för att utveckla standardiserade, djurfria BoNT testning och kvantifieringsmetoder ^35-39. Nyligen har flera alternativa BoNT kvantifieringsmetoderna utvecklats som erbjuder mus eller nästan bioassay på möss känslighet ^40-49. Dessa metoder använder ofta fluorescens, masspektrometri, eller immunologiska metoder och erbjuda analystider avsevärt kortare än bioassay med möss utan djur. Mass-spektrometri strategier i kombination med immunologisk techniqderingar har visat att detektera och kvantifiera BoNT som finns i livsmedel och andra komplexa prover, men krav utbildning av personal och specialutrustning gräns dessa analyser ^50-55. De flesta andra alternativa analyser inte är lätt tillämpliga på komplexa provtestning eller saknar kapacitet som krävs för rutin BoNT testning. Den mycket varierande karaktär av livsmedelsprov viskositet, pH, salthalt, och matrisbeståndsdelar utgör en särskilt svår utmaning när man försöker utveckla in vitro analysmetoder med känslighet för att matcha den extrema styrkan av BoNT. Dessutom, även enkla och förhållandevis godartade buffertsystem, såsom de som följer av resuspension av BoNT-baserade läkemedelsprodukter, innehåller salt, albumin, och socker stabilisatorer (dvs. hjälpämnen) som väsentligt påverkar in vitro BoNT potens ^56. Toxin rening krävs för noggrann aktivitetstestning av alla utom de enklaste av proverna ^56-59.

DenBoTest Matrix-analyser var utformade för snabb, hög genomströmning, och konsekvent kvantifiering av BoNT från mycket komplexa prover med utrustning som vanligen finns i forskningslaboratorier ^56,60. Dessa analyser använder paramagnetiska pärlor kovalent kopplade till serotyp-specifika anti-Bont antikroppar att binda och binda BoNT ur ett prov och sedan ta bort störande matrisföreningar genom tvättning. Efter tvätt, är bunden BoNT proteolytiska aktiviteten sedan kvantifieras i en optimerad reaktionsbuffert med hjälp av en reporter kompatibelt med BoNT serotyp som testas. Dessa reportrar är fluorogena proteiner som består av en N-terminal cyan fluorescerande protein (GFP)-grupp och en C-terminal gula fluorescerande proteinderivat (Venus)-del förenade genom en BoNT substrat, SNAP25 rester 141-206 eller synaptobrevin rester 33-94 utgör den BoTest A / E eller B / D / F / G reportrar, respektive ^45. Reporter klyvning med BoNT övervakas med Försters resonansenergiöverföring (FRET). När than reporter är intakt, excitation av den gemensamma fiskeripolitiken leder FRET till Venus, härdning CFP utsläpp och spännande Venus utsläpp. Klyvning av reporter av BoNT förhindrar FRET, vilket leder till en ökning av GFP emission och minskning i Venus emission. BoNT aktivitet kan sedan mätas kvantitativt med hjälp av förhållandet mellan den gemensamma fiskeripolitiken och Venus utsläpp. LOD under 3 pg är möjligt från en mängd olika livsmedel med en hög genomströmning 96-brunnar format ^56. Ökad känslighet kan erhållas med användning av större provvolymer, eftersom analysen möjliggör koncentration av toxinet på pärlans yta.

De BoTest Matrix analyser för BoNTs A, B, E, och F har utvecklats och testats med livsmedel, läkemedel, och miljöprover ^56,60. Här beskriver vi rutiner för att utföra dessa analyser för detektion av BoNT i låg komplexitet (t.ex. läkemedel, BoNT i buffert) och hög komplexitet (t.ex. livsmedel, miljö) prover. Särskilda bearbetningsmetoderflera provtyper behandlas i detta protokoll och provtyper som inte beskrivs här kan oftast anpassas med hjälp av en kombination av de presenterade metoderna. Protokollet har utvecklats och testats med BoNT / A, men kan anpassas till andra BoNT serotyper använder sina respektive analyser som visats på annat håll ^56,60.

Protocol

1. Framställning av analysreagens Thaw 200x ditiotreitol (DTT), 10x Matrisbindningsbuffert (10x bindningsbuffert i det följande), 10x neutraliseringsbuffert (livsmedel eller pH obalanse prover endast), och 10x BoTest reaktionsbuffert (10 x reaktionsbuffert nedan) vid rumstemperatur (RT) under 15 min eller tills den är helt upptinad. Se tabell 1 för en lista över buffertar och reagenser som används i detta protokoll. Se tabell 2 för en lista på material och utrustning …

Representative Results

Ett diagram som sammanfattar de steg i den beskrivna protokollet visas i fig. 2. Analysen kräver mellan 4-26 timmar att slutföra, beroende på provtyp och önskad analyskänslighet, men bara ~ 2 timmar av praktisk tid. Analysen utförs i 96-brunnsplattor och, beroende på den typ av tester som skall utföras, möjliggör triplikat testning av upp till 20 prover inklusive standarder per platta. Figur 3 visar representativa analysresultat med användning av …

Discussion

Detta protokoll beskriver förfaranden för att kvantifiera BoNT / Komplex, holotoxin eller Clostridium odlingssupematant i komplexa matriser. Protokollet är densamma, men när man testar andra BoNT serotyper (t.ex. BoNT / B, E, och F) med deras respektive Matrix analyser ^56,60, även om analyskänsligheten varierar mellan serotyper och analyser. Detta protokoll tar inte hänsyn till varje typ av prov är möjligt och vissa modifieringar kan krävas beroende på det specifika provet sammans…

Materials

BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit	BioSentinel	A1015	Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader	Thermo-Fisher Scientific	5250040	Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate	V&P Scientific	VP771H	Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer	BioTek	ELx405 VSRM	Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge	Various	N/A	Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer	Eppendorf	22674200
Orbital Shaker	Various	N/A	Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets	Roche	4693132001	Only required for food or environmental testing.  Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A	Metabiologics	N/A	Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates	NUNC	237105	Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape	Thermo Scientific	15036