Nanofibers חלבון ECM ועצרת ביוזמת פני שטח באמצעות ננו תכנון הנדסי
Summary
שיטה להשיג nanofibers וננו המורכב מחלבונים מטריצת חוץ תאיים בודדים או מרובים מתוארת. שיטה זו משתמשת באינטראקציות חלבון פני השטח כדי ליצור חומרים המבוססים על חלבונים חופשיים עומדים עם הרכב מתכונן וארכיטקטורה לשימוש במגוון רחב של יישומי הנדסה וביוטכנולוגיה רקמות.
Abstract
המטריצה תאית (ECM) ברקמות היא מסונתזת ונאספה על ידי תאים ליצירת סיבי 3D, רשת חלבון עם מוסדר היטב בקוטר סיבים, קומפוזיציה וארגון. בנוסף למתן תמיכה מבנית, התכונות הפיסיקליות וכימיות של ECM לשחק תפקיד חשוב בתהליכים תאיים רבים, כולל הידבקות, בידול, ואפופטוזיס. בvivo, ECM מורכב על ידי חשיפת הרכבה עצמית הנסתרת אתרים (fibrillogenesis) בתוך חלבונים . תהליך זה משתנה לחלבונים שונים, אבל fibrillogenesis פיברונקטין (FN) מאופיין היטב ומשמש כמערכת מודל להרכבת ECM תא בתיווך. באופן ספציפי, תאים משתמשים בקולטנים integrin על קרום התא כדי לאגד הדימרים FN וכוחות התכווצות-actomyosin נוצר כדי להתפתח ולחשוף את אתרי קישור להרכבה לסיבים לא מסיסים. תהליך בתיווך קולטן זה מאפשר לתאים כדי להרכיב ולארגן ECM מהסלולרי לSCA רקמהles. כאן, אנו מציגים שיטת הרכבה מכונה ביוזמת פני השטח (SIA), אשר משחזרת הרכבה מטריצת תא בתיווך באמצעות אינטראקציות חלבון פני השטח כדי להתפתח חלבוני ECM ולהרכיב אותם לסיבים לא מסיסים. ראשית, חלבוני ECM הם על adsorbed polydimethylsiloxane הידרופובי פני השטח (PDMS) שבו הם לפגל באופן חלקי (unfold) ולחשוף תחומים המחייבים נסתרים. אז חלבוני פרש מועברים במייקרו וnanopatterns המוגדרים היטב באמצעות הדפסת microcontact על פולי תרמית מגיבים (N-isopropylacrylamide) פני השטח (PIPAAm). פירוק תרמי-מופעל של PIPAAm מוביל להרכבה ושחרורו של nanofibers מסיס חלבון ECM וננו בגיאומטריות מוגדרות היטב סופיים. ארכיטקטורות מורכבות אפשריות על ידי דפוסים הנדסיים מוגדר על בולי PDMS המשמשים להדפסת microcontact. בנוסף לFN, תהליך SIA ניתן להשתמש עם laminin, פיברינוגן וcollagens להקליד אני ורביעי כדי ליצור nanostruc ECM מרובה רכיביםטורס. לפיכך, SIA יכול לשמש מהנדס חומרים מבוסס חלבון ECM עם שליטה מדויקת על הרכב חלבון, סיבי הגיאומטריה ואדריכלות פיגום על מנת לשחזר את המבנה והרכב של ECM in vivo.
Introduction
המטריצה תאית (ECM) ברקמות מורכבת מחלבונים רב תכליתיים המעורבים בויסות פיסיקלית וכימית של תהליכים בתא מרובים, כולל הידבקות, התפשטות, התמיינות, ואפופטוזיס 1-3. ECM הוא מסונתז, התאסף, ומאורגן על ידי תאים ויש להם את סיבי החלבון המרכיבים את יצירות ייחודיות, גודל סיבים, גיאומטריות וארכיטקטורות המחוברים ביניהם משתנות עם סוג רקמה ושלב התפתחותי. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי ECM יכול לספק מאלפות רמזים שינחה את התאים ליצירת רקמות מהונדסות 4, המצביעה על כך משחזר ECM במונחים של הרכב ומבנה עשוי לאפשר הפיתוח של חומרי biomimetic עבור יישומי הנדסה וביוטכנולוגיה רקמות.
מספר שיטות ייצור פותחו כדי להנדס פיגומים פולימריים שיכול לחקות היבטים של ECM ברקמות. לדוגמא, electrospinning ומפריד, שלבation שניהם הפגין היכולת ליצור מטריצות נקבוביות של סיבים בקטרים הנעים בין עשרות מיקרומטר עד עשרות ננומטרים 5-7. גם שני הטכניקות הראו כי מטריצות נקבוביות ביותר של nanofibers יכולות לתמוך הידבקות תא וחדיר לפיגום 8. עם זאת, גישות אלו מוגבלות בגיאומטריות סיבים, אוריינטציות ו3D הארכיטקטורות אפשריות שיכול להיות שנוצרו. Electrospinning בדרך כלל מייצר פיגומים בסיבים או בכיוון או מיושרים מאוד באופן אקראי ואילו הפרדת פאזות מייצרת פיגומים עם סיבים בכיוון באופן אקראי. יש גם מגבלות על החומרים, עם חוקרים בדרך כלל משתמשים בפולימרים סינטטיים, כגון פולי (ε-caprolactone) 8 ופולי (חומצה לקטית-Co-גליקולית) 9, כי הם מצופים לאחר מכן עם חלבוני ECM לקדם הידבקות תא. biopolymers הטבעית משמשות גם, לרבות סוג קולגן אני 10, ג'לטין 11, פיברינוגן 12,chitosan 13, ומשי 14, אבל מייצגים קבוצה קטנה בלבד של החלבונים הנמצאים ברקמות מקומיות. רוב הרקמות מכילות סביבה גדולה יותר של חלבוני ECM וסוכרים כוללים פיברונקטין (FN), laminin (LN), סוג IV קולגן וחומצה היאלורונית שקשים או בלתי אפשריים לפברק nanofibers תוך שימוש בשיטות קיימות.
כדי להתמודד עם אתגר זה, אנו מתמקדים מאמצי המחקר שלנו במחקו את הדרך בה תאים לסנתז, להרכיב ולארגן את סיבי חלבון ECM בסביבתם. בעוד תהליך fibrillogenesis הספציפי משתנה לחלבוני ECM שונים, בדרך כלל שינוי קונפורמציה במולקולת חלבון ECM מופעל על ידי האנזימטית או אינטראקציה קולטן בתיווך, אשר חושף אתרי הרכבה עצמית נסתרים. כאן אנו משתמשים FN כמערכת מודל להבין את תהליך fibrillogenesis טוב יותר. בקצרה, homodimers FN להיקשר לקולטנים integrin על פני התא באמצעות רצף חומצות אמינו RGD בסוג 10th השניאני חוזר ליחידה. ברגע שחייב, integrins לנוע בנפרד באמצעות התכווצות actomyosin ולהתפתח הדימרים FN לחשוף אתרי הרכבה עצמית נסתרים. החשיפה של האתרים הללו FN-FN המחייבים מאפשרת הדימרים FN להרכיב ליפון מסיס תקין על פני תא 15. עבודה במערכות תא ללא הוכיחה שיכולים להתגלות אתרי FN-FN נסתרים מחייבים דרך התגלגלות באמצעות denaturants 16 או מתח פנים בנוזל מוצק אוויר ממשק 17-19. עם זאת, סיבי FN נוצרו על ידי טכניקות אלה מוגבלים לגדלי סיבים ספציפיים וגיאומטריות ומחויבות בדרך כלל למשטח.
כאן אנו מתארים הרכבה גישה שמכונה ביוזמת פני השטח (SIA) 20 שמתגברת על מגבלות אלה על ידי ניצול אינטראקציות חלבון פני השטח כדי ליצור nanofibers חופשי עומד מסיס, nanofabrics (גיליונות 2D) ואחרים ננו מורכב מחלבוני ECM בודדים או מרובים (איור 1 ). בעמ 'זהrocess, חלבוני ECM הם adsorbed מקונפורמציה קומפקטית, כדורית בפתרון ומפוגל באופן חלקי (פרש) על גבי חותמת בדוגמת, polydimethylsiloxane הידרופובי (PDMS). אז חלבוני ECM מועברים במצב זה על פולי תרמית מגיבים (N-isopropylacrylamide) פני השטח (PIPAAm) באמצעות הדפסת microcontact 22. כאשר hydrated עם מים 40 ° C PIPAAm נותר מוצק, אבל כאשר התקררו 32 מעלות צלזיוס הוא עובר דרך טמפרטורה קריטית נמוך פתרון (LCST) שבו הוא הופך להיות הידרופילי, מתנפח עם מים ולאחר מכן מתמוסס, משחרר ננו ECM התאסף הנחה של על פני השטח. שיטת SIA מספקת שליטה על הממדים עם דיוק בקנה מידה ננומטרי. על ידי שליטה בפרמטרים מרכזיים כמו הרכב, גיאומטריה סיבים, ואדריכלות, אפשר לשחזר מאפיינים רבים של ECM מצאו in vivo ולפתח פיגומים מתקדמים עבור יישומי הנדסה וביוטכנולוגיה רקמות.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת SIA מוצגת כאן מחקה הרכבה מטריצת תא בתיווך ומאפשרת להנדסה של nanofibers חלבון ECM וננו עם גודל מתכונן, ארגון וקומפוזיציה. אמנם לא זהה לECM-תא שנוצר, SIA יוצר ECM מורכב מסיבי חלבון ננו 20 שעוברים קיפול הפיך / התגלגלות במהלך מאמץ מכאני 21 ויכולים להיקשר לתאים 20. זה…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העניקה תמיכה כספית לJMS מיומכניקה NIH בתכנית רפואת רגנרטיבית T32 הדרכה (2T32EB003392), לQJ ממלגת דאוד-ICES וAWF מפרס ממציא ניו המנהל של NIH (1DP2HL117750).
Materials
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
References
- Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 793-805 (2001).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. . Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. l. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Teo, W. E., Ramakrishna, S. A review on electrospinning design and nanofibre assemblies. Nanotechnology. 17, (2006).
- Reneker, D. H., Chun, I. Nanometre diameter fibres of polymer, produced by electrospinning. Nanotechnology. 7, 216-21 (1996).
- Ma, P. X., Zhang, R. Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix. Journal of Biomedical Materials Research. 46, 60-72 (1999).
- Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60, 613-621 (2002).
- Matthews, J. A., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. . Electrospinning of Collagen Nanofibers. Biomacromolecules. 3, 232-238 (2002).
- Huang, Z. -. M., Zhang, Y. Z., Ramakrishna, S., Lim, C. T. Electrospinning and mechanical characterization of gelatin nanofibers. Polymer. 45, 5361-5368 (2004).
- Wnek, G. E., Carr, M. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. . Electrospinning of Nanofiber Fibrinogen Structures. Nano Letters. 3, 213-216 (2002).
- Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility. Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).
- Jin, H. -. J., Chen, J., Karageorgiou, V., Altman, G. H., Kaplan, D. L. Human bone marrow stromal cell responses on electrospun silk fibroin mats. Biomaterials. 25, 1039-1047 (2004).
- Wierzbicka-Patynowski, I., Schwarzbauer, J. E. The ins and outs of fibronectin matrix assembly. Journal of Cell Science. 116, 3269-3276 (2003).
- Mosher, D. F., Johnson, R. B. In vitro formation of disulfide-bonded fibronectin multimers. Journal of Biological Chemistry. 258, 6595-6601 (1983).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biology. 27, 451-461 (2008).
- Ulmer, J., Geiger, B., Spatz, J. P. Force-induced fibronectin fibrillogenesis in vitro. Soft Matter. 4, 1998-2007 (2008).
- Klotzsch, E., et al. Fibronectin forms the most extensible biological fibers displaying switchable force-exposed cryptic binding sites. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. , (2009).
- Feinberg, A. W., Parker, K. K. Surface-Initiated Assembly of Protein Nanofabrics. Nano Letters. 10, 2184-2191 (2010).
- Deravi, L. F., et al. Differential Contributions of Conformation Extension and Domain Unfolding to Properties of Fibronectin Nanotextiles. Nano Letters. 12, 5587-5592 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J Vis Exp. , 1065 (2008).
- Vogel, V. Mechanotransduction Involving Multimodular Proteins: Converting Force into Biochemical Signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
