表面開始アセンブリの使用ECMタンパク質のナノファイバーおよびナノ構造エンジニア
Summary
単一または複数の細胞外マトリックスタンパク質からナノファイバーおよび複合ナノ構造体を得るための方法が記載されている。この方法は、組織工学及びバイオテクノロジーの様々なアプリケーションで使用するために調整可能な組成物およびアーキテクチャに自立タンパク質ベースの材料を作成するために、タンパク質 – 表面相互作用を使用する。
Abstract
組織中の細胞外マトリックス（ECM）は、厳密に調節繊維径、組成および組織と3D繊維状タンパク質ネットワークを形成する細胞によって合成され、組み立てられる。構造的支持を提供することに加えて、ECMの物理的および化学的特性、接着、分化、およびアポトーシスを含む多数の細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしている。 インビボで 、ECMは、タンパク質内の潜在性自己組織化（線維化）部位を露出させることによって組み立てられる。このプロセスは、異なるタンパク質を異なるが、フィブロネクチン（FN）原線維は、十分に特徴付けされ、細胞媒介ECMアセンブリのためのモデル系として働く。具体的には、細胞が不溶性繊維にアセンブリのための結合部位を展開し、公開するために、FNの二量体およびアクトミオシンで生成された収縮力を結合するために、細胞膜上のインテグリン受容体を使用しています。この受容体を介したプロセスは、組織SCAに携帯からECMを組み立て、整理するために、細胞を可能にしますレ。ここでは、ECMタンパク質をアンフォールドし、不溶性繊維にそれらを組み立てるために、タンパク質 – 表面相互作用を用いて細胞媒介性マトリックス立体を再現する方法と呼ばれる表面開始アセンブリ（SIA）を提示する。まず、ECMタンパク質は、それらが部分的に（アンフォールド）変性させ、潜在的結合ドメインを露出疎水性ポリジメチルシロキサン（PDMS）表面に吸着される。折り畳まれたタンパク質は、その後、熱応答性ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）（グラフティング）表面上にマイクロコンタクト印刷により明確に定義されたミクロおよびナノパターンの中に転送される。グラフティングの熱トリガー溶解が最終組み立てと明確に定義された形状を有する不溶性ECMタンパク質ナノファイバーおよびナノ構造の放出をもたらす。複雑なアーキテクチャは、マイクロコンタクト印刷に使用するPDMSスタンプ上に定義されたパターンを操作することによって可能である。ラミニン、フィブリノーゲンおよびコラーゲンIおよびIVは、多成分ECMのnanostrucを作成するために入力してFNに加えて、SIAプロセスを使用することができるトゥーレス。このように、SIAは、 インビボで ECMの構造及び組成を再現するために、タンパク質組成物、繊維形状及び足場アーキテクチャを高い精度で制御するECMタンパク質ベースの材料を操作するために使用することができる。
Introduction
組織中の細胞外マトリックス（ECM）の接着、増殖、分化、およびアポトーシス1-3を含む複数の細胞プロセスの物理的および化学的調節に関与する多機能性タンパク質で構成されている。 ECMは、合成され組み立てられ、かつ細胞によって組織され、構成タンパク質線維は、組織の種類と発達段階に応じて変動独特の組成物、繊維サイズ、形状及び相互接続されたアーキテクチャを持っている。最近の研究は、ECMの組成および構造の点でECMをrecapitulatingする組織工学および生物工学用途のためのバイオミメティック材料の開発を可能にするかもしれないことを示唆している、操作された組織4を形成するために細胞を導くために有益な手がかりを提供することができることを実証した。
製造方法の数は、組織中のECMの態様を模倣することができるポリマー足場を設計するために開発されている。例えば、エレクトロスピニングと位相SEPARATIONは、両方のダウン数十マイクロメートルから数十ナノメートル5-7の範囲の直径を有する繊維の多孔質マトリックスを形成する能力を実証した。両方の技術はまた、ナノファイバーの高度に多孔性マトリックスが足場8への細胞接着および浸潤をサポートできることを示している。しかしながら、これらのアプローチを作成することができる可能な繊維の幾何学的形状、配向および3次元のアーキテクチャで制限される。相分離がランダムに配向した繊維で足場を作り出すのに対して、電界紡糸は、一般的にランダムに配向または高度に整列いずれかの繊維と足場を生成します。材料の制限は、研究者は、典型的には、ポリ続いて、細胞接着を促進するために、ECMタンパク質でコーティングされている（ε-カプロラクトン）8、ポリ（乳酸-co-グリコール酸）9などの合成ポリマーを用いても存在する。天然のバイオポリマーはまた、コラーゲンタイプI 10、11、ゼラチン、フィブリノゲン12を含め、使用されているキトサン13、シルク14が、ネイティブ組織に見られるタンパク質の小さなサブセットのみを表しています。ほとんどの組織は、既存の方法を使用してナノファイバーを製造することが困難または不可能であるフィブロネクチン（FN）、ラミニン（LN）、IV型コラーゲンおよびヒアルロン酸などのECMタンパク質および多糖類の大きい環境を含む。
この課題に対処するために、我々は彼らの周囲のECMタンパク質の線維を組み立て、整理、細胞が合成する方法を模倣する上で我々の研究努力を集中してきた。特定の線維形成プロセスが異なるECMタンパク質によって異なりますが、一般的に、ECMタンパク質分子の立体構造変化は、暗号のような自己組織化サイトを公開し、酵素や受容体を介した相互作用によって引き起こされます。ここでは、より良い線維形成過程を理解するためのモデル系として、FNを使用しています。簡潔には、FNホモダイマー、第10タイプIIにRGDアミノ酸配列を介して細胞表面上のインテグリン受容体に結合する私はユニットを繰り返します。一度結合すると、インテグリンは、アクトミオシンの収縮を経由して離れて移動して、暗号のような自己組織化サイトを公開するために、FNの二量体を展開。これらのFN-FN結合部位の露出は右のセル表面15に不溶性の線維に組み立てるために、FNダイマーを可能にします。無細胞系での作業は、不可解なFN-FN結合部位は、空気-液体-固体界面17から19に、変性剤16又は表面張力を使用して展開を通じて明らかにすることができることを実証した。しかしながら、これらの技術によって作成されたFN繊維は、特定の繊維のサイズおよび形状に制限され、典型的には表面に結合される。
ここでは、アプローチが自立不溶性ナノファイバー、nanofabrics（2Dシート）および単一または複数のECMタンパク質からなる他のナノ構造を作成するために、タンパク質-表面相互作用を利用することによって、これらの制限を克服する表面開始アセンブリ（SIA）20（ 図1と呼ばれる記述）。このP INrocessは、ECMタンパク質は、パターン化された、疎水性のポリジメチルシロキサン（PDMS）スタンプの上にコンパクトな球状溶液中のコンホメーションと部分的に変性（アンフォールド）から吸着される。 ECMタンパク質は、次いで、22マイクロコンタクト印刷を介して熱応答性ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）（グラフティング）表面上に、この状態で転送される。 40°Cの水で水和するときグラフティングは、固体のままであるが、32℃に冷却したときに、それが親水性となる下限臨界溶液温度（LCST）を通過し、水で膨潤し、次いで溶解するのオンオフ組み立てられたECMのナノ構造体を解放する表面。 SIA法は、ナノメートルスケールの精度で寸法を制御します。そのような組成物、繊維形状、アーキテクチャなどの重要なパラメータを制御することにより、 インビボで見出さECMの多くの特性を再現し、組織工学及びバイオテクノロジーの用途のための高度な足場を開発することが可能である。
Protocol
Representative Results
Discussion
SIA法は、模倣細胞媒介マトリックスアセンブリここに提示され、調整可能なサイズ、組織と組成物とECMタンパク質ナノファイバーおよびナノ構造のエンジニアリングを可能にします。細胞で生成されたECMとは同一ではないが、SIAは機械的ひずみ21の間に展開/折りたたみ可逆を受け、細胞を20と結合することができるナノスケールのタンパク質線維20で構成され…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
財政支援は、NIH Directorの新イノベーター賞（1DP2HL117750）からダウド-ICESフェローシップからQJにし、アジア女性基金に、再生医療T32トレーニングプログラム（2T32EB003392）にNIHのバイオメカニクスからJMSに提供された。
Materials
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
References
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