Bestemmelse af isbindende fly af frostvæskeproteiner ved fluorescens-baserede Ice Plane Affinitet
Summary
Frostvæskeproteiner (AFP’er) binder sig til specifikke isplaner for at forhindre eller bremse isvækst. Fluorescens-baserede isplan affinitet (FIPA) analyse er en ændring af den oprindelige is-ætsning metode til bestemmelse af AFP-bundet is planer. AFP’er er fluorescerende mærket, indarbejdet i makroskopiske enkeltiskrystaller og visualiseret under UV-lys.
Abstract
Frostvæskeproteiner udtrykkes i en række koldhårde organismer for at forhindre eller bremse indre isvækst. AFP’er binder sig til specifikke isplaner gennem deres isbindende overflader. Fluorescensbaseret isplansaffinitetsanalyse (FIPA) er en modificeret teknik, der bruges til at bestemme de isplaner, som AFP’erne binder sig til. FIPA er baseret på den oprindelige is-ætsning metode til bestemmelse af AFP-bundet is-fly. Det giver klarere billeder i en forkortet eksperimentel tid. I FIPA-analyse er AFP’er fluorescerende mærket med et kimært mærke eller et kovalent farvestof, der derefter langsomt indarbejdes i en makroskopisk enkelt iskrystal, som er blevet præformeret til en halvkugle og orienteret til at bestemme a- og c-akserne. Den AFP-bundet is halvkugle er afbildet under UV-lys til at visualisere AFP-bundet fly ved hjælp af filtre til at blokere uspecifikke lys. Fluorescerende mærkning af AFP’er giver mulighed for real-time overvågning af AFP adsorption i is. Etiketterne har vist sig ikke at påvirke de fly, som AFP’er binder sig til. FIPA analyse introducerer også mulighed for at binde mere end én forskelligt mærket AFP på samme enkelt is krystal til at hjælpe differentiere deres bindende fly. Disse anvendelser af FIPA er med til at fremme vores forståelse af, hvordan AFP’er binder sig til is for at standse dens vækst, og hvorfor mange AFP-producerende organismer udtrykker flere AFP-isoformer.
Introduction
Produktionen af frostvæskeproteiner (AFP’er) er en vigtig overlevelsesmekanisme for nogle organismer, der lever i isbelastede miljøer. Indtil for nylig blev det antaget, at den eneste funktion af AFP’er var at forhindre eller bremse væksten af interne iskrystaller, der ville blokere omsætning, forårsage vævsskader og osmotisk stress. Organismer, der ikke kan tolerere nogen grad af frysning, såsom fisk, udtrykker AFP’er for helt at hæmme iskrystalvækst1. Andre, såsom græs, er fryse tolerante og udtrykke AFPs at hæmme is recrystallization som reducerer dannelsen af store iskrystaller i deres væv2. Stabilisering af membraner ved lav temperatur er endnu en funktion, der blev foreslået for AFP’erne3. For nylig blev en ny rolle foreslået for AFP af en antarktisk bakterie, Marinomonas primoryensis, fra isdækkede brakvandssøer4. Denne AFP er en del af en meget større adhesin protein5, der menes at knytte bakterien til is for bedre adgang til ilt og næringsstoffer6. Andre mikrober er kendt for at udskille AFP’er, som kan ændre strukturen af isen, hvor de bor7.
AFP’er er fundet i nogle fisk, insekter, planter, alger, bakterier, diatomer og svampe. De har bemærkelsesværdigt forskellige sekvenser og strukturer i overensstemmelse med deres udvikling fra forskellige forfædre ved forskellige lejligheder; og alligevel binder de sig alle til is og hæmmer dens vækst ved adsorptionshæmmende mekanisme8. AFP’erne har hver især en specifik overflade, der fungerer som det isbindende sted (IBS). Disse er typisk blevet identificeret ved stedsstyret mutagenese af overfladerester9-11. IBS er hypotese at arrangere vandmolekyler i en is-lignende mønster, der matcher specifikke planer af is. Således AFP danner sin ligand før bindende for det5, 12. Isplaner kan defineres af deres Miller-indekser, og forskellige AFP’er kan binde sig til forskellige planer. Således type I AFP fra vinter skrubbe binder sig til 20-21 pyramideformede planer13, type III AFP binder både primære prisme og pyramideformede planer ved hjælp af en sammensat is-bindende overflade11,14, mens gran budworm AFP, en hyperaktiv AFP, binder samtidig til både den primære og basale fly15,16. Andre hyperaktive AFP’er, såsom MpAFP, binder sig til flere isplaner som vist ved deres komplette dækning af enkelt iskrystallerhalvdele5,17. Det er hypotese, at evnen til hyperaktive AFP’er til at binde basalplanet såvel som andre planer kan tegne sig for deres 10 gange højere aktivitet over moderat aktive AFP’er18. Selv om effektiviteten af hyperaktive AFP’er er veldokumenteret, er deres evne til at binde sig til flere isplaner stadig ikke forstået.
Den oprindelige metode til bestemmelse af AFP-bundet is fly blev udviklet af Charles Knight13,19. I denne metode monteres en makroskopisk enkelt iskrystal på en hul metalstang (kold finger) og dannes til en halvkugle ved at nedsænke den i en halvkugleformet kop fyldt med afgasset vand. Derefter nedsænkes halvkuglen i en fortyndet opløsning af AFP’er, og et lag is dyrkes fra AFP-opløsningen på iskrystalhalvlen over flere timer kontrolleret af temperaturen på ethylenglycolen, der cirkulerer gennem den kolde finger. Iskrystallerne fjernes fra opløsningen, løsnes fra den kolde finger og placeres i et fryserum på -10 til -15 °C. Overfladen skrabes med et skarpt blad for at fjerne den frosne overfladefilm af frostvæskeproteinopløsning, og iskrystallerne får lov til at sublimere i mindst 3 timer. Efter sublimering kan isplanerne bundet af AFP’er ses som hvide ætsede mønstre afledt af restprotein. Ishalvkuglen kan orienteres mod sin c-akse og en-akser for at finde de basale og prisme planer af is, og bestemme Miller indekser af ætset patches.
Her beskriver vi en ændring af den oprindelige metode til bestemmelse af AFP-bundne isplaner, en metode, vi kalder fluorescensbaseret isplantilfinitet (FIPA)11. AFP’erne er fluorescerende mærket med enten et kimært mærke, såsom grønt fluorescerende protein (GFP)11,16,17,20, eller med et fluorescerende farvestof, der er kovalent bundet til AFP5,21. De fluorescerende mærkede AFP’er adsorberes til en enkelt iskrystal og tilgroes ved hjælp af den samme eksperimentelle procedure som de oprindelige is-ætsning eksperimenter. Omfanget af AFP binding til den voksende is halvkugle kan overvåges i hele forsøget ved hjælp af en ultraviolet (UV) lampe. Når eksperimentet er afsluttet, kan halvkuglen tages direkte af den kolde finger og afbildes uden sublimering. Men hvis det ønskes, kan halvkuglen overlades til sublimere for at visualisere en traditionel is etch. Ændringer, der indføres i FIPA-metoden, forkorter den traditionelle isætsningsprotokol med flere timer. Derudover er der potentiale for samtidig billeddannelse flere AFPs, hver med en anden fluorescerende etiket, at visualisere overlappende mønstre AF-bundet is planer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Udvikling af is-ætsning metode af Charles Knight til bestemmelse af AFP-bundet is fly meget avancerede undersøgelser af mekanismen for isbinding af AFPs. Mens strukturer af AFP’er kunne løses ved røntgenkrystallografi26,27, var der ingen indlysende metode til at udlede den komplementære overflade på is, som AFP bundet til. Når type I AFP fra vinter skrubbe oprindeligt blev karakteriseret, blev det hypotese at binde sig til de primære prisme fly af is28. Men Knight’s banebrydende is-ætsning …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PLD har Canada Research Chair i Protein Engineering. Dette arbejde blev finansieret af et tilskud fra den canadiske Institutes of Health Research til PLD. Dette arbejde blev også støttet af en Grant-in-Aid til videnskabelig forskning fra Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (nr. 23310171) og fra Japan Bio-oriented Technology Research Advancement Institution (BRAIN). Vi er taknemmelige for Drs. Chris Marshall og Mike Kuiper for banebrydende arbejde, der førte til FIPA. Vi er også taknemmelige for Dr. Sakae Tsuda for at give faciliteter til noget af dette arbejde og til Dr. Laurie Graham for at oprette fluorescerende lys excitation og emissionsfiltre.
Materials
| NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators | Thermo Scientific | RTE7 | |
| Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant | Certified | 29-3037-0 | Common automotive antifreeze |
| Cold finger | not available | not available | Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter) |
| Hemispherical cup | not available | not available | Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter) |
| High Dual Output Lighting System | Lightools Research | LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX | Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research |
| Camera | Canon | EOS 50D | |
| Emission Filters | Lightools Research | LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG | Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens |
References
- Devries, A. L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes. Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).
- Sidebottom, C., et al. Phytochemistry – heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).
- Tomczak, M. M., et al. A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein. Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).
- Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ca2+-dependent+antifreeze+protein+in+an+antarctic+bacterium.”>Hyperactive Ca2+-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).
- Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity. Plos One. 7 (11), (2012).
- Raymond, J. A. Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).
- Raymond, J. A., Devries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).
- Baardsnes, J., et al. New ice-binding face for type i antifreeze protein. FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
- Garnham, C. P., et al. Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging. Biochimie. 49 (42), 9063-9071 (2010).
- Nutt, D. R., Smith, J. C. Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations. J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Antson, A. A., et al. Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins. J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).
- Graether, S. P., et al. Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect. Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).
- Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity. Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).
- Middleton, A. J., et al. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).
- Scotter, A. J., et al. The basis for hyperactivity of antifreeze proteins. Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).
- Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results. Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).
- Hakim, A., et al. Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding. J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).
- Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice. FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).
- Holt, C. B. The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study. Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).
- Knight, C. A. A simple technique for growing large, optically ”perfect” ice crystals. J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).
- Hobbs, P. V. . Ice physics. , 200-248 (1974).
- Knight, C. Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones. J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).
- Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications. Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).
- Sicheri, F., Yang, D. S. Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder. Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).
- Devries, A. L. Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes. Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).
- Pertaya, N., et al. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).
- Kondo, H., et al. Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).
- Mok, Y. F., et al. Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein. Biochimie. 49 (11), 2593-2603 (2010).
- Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein. FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).
- Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins. J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).
- Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).
- Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites. BMC Struct. Biol. 11, (2011).
