Determinazione dei piani di legame del ghiaccio delle proteine antigelo mediante affinità del piano di ghiaccio basata sulla fluorescenza
Summary
Le proteine antigelo (AFP) si legano a specifici piani di ghiaccio per prevenire o rallentare la crescita del ghiaccio. L’analisi FIPA (Ice Plane Affinity) basata sulla fluorescenza è una modifica del metodo originale di incisione del ghiaccio per la determinazione dei piani di ghiaccio legati all’AFP. Gli ARP sono etichettati fluorescentmente, incorporati in cristalli di ghiaccio singoli macroscopici e visualizzati sotto la luce UV.
Abstract
Le proteine antigelo (ARP) sono espresse in una varietà di organismi duri a freddo per prevenire o rallentare la crescita interna del ghiaccio. Gli ARP si legano a piani specifici di ghiaccio attraverso le loro superfici leganti il ghiaccio. L’analisi FIPA (Ice Plane Affinity) basata sulla fluorescenza è una tecnica modificata utilizzata per determinare i piani di ghiaccio a cui si legano gli ARP. La FIPA si basa sul metodo originale di incisione del ghiaccio per determinare i piani di ghiaccio legati all’AFP. Produce immagini più chiare in un tempo sperimentale ridotto. Nell’analisi FIPA, gli ARP sono etichettati fluorescentmente con un tag chimerico o un colorante covalente, quindi lentamente incorporati in un cristallo di ghiaccio singolo macroscopico, che è stato preformato in un emisfero e orientato a determinare gli assi a e c. L’emisfero di ghiaccio legato all’AFP è stato visualizzato sotto la luce UV per visualizzare i piani legati all’AFP usando filtri per bloccare la luce non specifica. L’etichettatura fluorescente degli AFP consente il monitoraggio in tempo reale dell’adsorbimento AFP nel ghiaccio. È stato riscontrato che le etichette non influenzano i piani a cui si legano gli AFP. L’analisi FIPA introduce anche la possibilità di legare più di un AFP con tag diverso sullo stesso singolo cristallo di ghiaccio per aiutare a differenziare i loro piani di legame. Queste applicazioni della FIPA stanno contribuendo a far progredire la nostra comprensione di come gli AFP si legano al ghiaccio per fermare la sua crescita e perché molti organismi produttori di AFP esprimono più isoforme AFP.
Introduction
La produzione di proteine antigelo (AFP) è un importante meccanismo di sopravvivenza di alcuni organismi che vivono in ambienti carichi di ghiaccio. Fino a poco tempo fa, si pensava che l’unica funzione degli AFP fosse quella di prevenire o rallentare la crescita di cristalli di ghiaccio interni che avrebbero bloccato la circolazione, causato danni ai tessuti e stress osmotico. Gli organismi che non possono tollerare alcun grado di congelamento, come i pesci, esprimono ARP per inibire completamente la crescita dei cristalli dighiaccio 1. Altri, come l’erba, sono tolleranti al congelamento ed afps espliciti per inibire la ricristallizzazione del ghiaccio che riduce la formazione di grandi cristalli di ghiaccio nei lorotessuti 2. La stabilizzazione delle membrane a bassa temperatura è un’altra funzione suggerita per gli AFP3. Recentemente, è stato suggerito un nuovo ruolo per l’AFP di un batterio antartico, Marinomonas primoryensis, dai laghi salmastri ricoperti di ghiaccio4. Questo AFP fa parte di una proteina adessina molto piùgrande 5 che si pensa alleghi il batterio al ghiaccio per un migliore accesso all’ossigeno e ai nutrienti6. Altri microbi sono noti per secernore gli ARP, che potrebbero alterare la struttura del ghiaccio in cui vivono7.
Gli ARP sono stati trovati in alcuni pesci, insetti, piante, alghe, batteri, diatomee e funghi. Hanno sequenze e strutture notevolmente divergenti coerenti con la loro evoluzione da diversi progenitori in varie occasioni; eppure tutti si legano al ghiaccio e inibiscono la sua crescita con il meccanismo di adsorbimento-inibizione8. Gli ARP hanno ciascuno una superficie specifica che funge da sito di legame con il ghiaccio (IBS). Questi sono stati tipicamente identificati dalla mutagenesi site-directed dei residui superficiali9-11. Si ipotizza che l’IBS organizzi molecole d’acqua in uno schema simile al ghiaccio che corrisponde a specifici piani di ghiaccio. Così l’AFP forma il suo ligando prima di legarsiad esso 5, 12. I piani di ghiaccio possono essere definiti dai loro indici di Miller, e diversi ARP possono legarsi a piani diversi. Pertanto, il tipo I AFP dalla passera d’inverno si lega ai piani piramidali 20-2113, tipo III AFP lega sia il prisma primario che i piani piramidali utilizzando una superficie di legame del ghiacciocomposto 11,14, mentre il budworm abete rosso AFP, un AFP iperattivo, si lega contemporaneamente sia ai piani primario che basale15,16. Altri ARP iperattivi, come mpAFP, si legano a più piani di ghiaccio come dimostra la loro copertura completa di singoli emisferi di cristallo di ghiaccio5,17. Si ipotizza che la capacità degli AFP iperattivi di legare il piano basale, così come altri piani, possa tenere conto della loro attività 10 volte superiore rispetto agli AFP moderatamente attivi18. Sebbene l’efficienza degli AFP iperattivi sia ben documentata, la loro capacità di legarsi a più piani di ghiaccio non è ancora compresa.
Il metodo originale per determinare gli aerei di ghiaccio legati all’AFP è stato sviluppato da Charles Knight13,19. In questo metodo, un cristallo di ghiaccio singolo macroscopico è montato su un’asta metallica cava (dito freddo) e formato in un emisfero immergendolo in una tazza emisferica piena di acqua degassata. Quindi, l’emisfero viene immerso in una soluzione diluita di ARP e uno strato di ghiaccio viene coltivato dalla soluzione AFP sull’emisfero cristallino di ghiaccio per diverse ore controllato dalla temperatura del glicole etilenico che circola attraverso il dito freddo. Il cristallo di ghiaccio viene rimosso dalla soluzione, staccato dal dito freddo e posto in una stanza congelatore da -10 a -15 °C. La superficie viene raschiata con una lama affilata per rimuovere il film superficiale congelato della soluzione proteica antigelo e il cristallo di ghiaccio può sublimare per almeno 3 ore. Dopo la sublimazione, i piani di ghiaccio legati dagli ARP possono essere visti come modelli incisi bianchi derivati da proteine residue. L’emisfero di ghiaccio può essere orientato al suo asse ce a-assi, per localizzare i piani basali e prismaci del ghiaccio, e determinare gli indici di Miller delle macchie incise.
Qui descriviamo una modifica del metodo originale per determinare i piani di ghiaccio legati all’AFP, un metodo che definiamo affinità del piano di ghiaccio a base di fluorescenza (FIPA)11. Gli ARP sono etichettati fluorescentmente con un tag chimerico, come la proteina fluorescente verde (GFP)11,16,17,20, o con un colorante fluorescente legato covalentemente all’AFP5,21. Gli AFP etichettati fluorescentmente sono adsorbiti in un singolo cristallo di ghiaccio e ricoperti dalla stessa procedura sperimentale degli esperimenti originali di incisione del ghiaccio. L’estensione del legame AFP con l’emisfero di ghiaccio in crescita può essere monitorata durante l’esperimento utilizzando una lampada ultravioletta (UV). Al termine dell’esperimento, l’emisfero può essere tolto direttamente dal dito freddo e immaginato, senza sublimazione. Tuttavia, se lo si desidera, l’emisfero può essere lasciato sublimare per visualizzare un’incisione di ghiaccio tradizionale. Le modifiche introdotte alla metodologia FIPA accorciano di diverse ore il tradizionale protocollo di incisione del ghiaccio. Inoltre, c’è il potenziale per l’imaging simultaneo di diversi AFP, ognuno con un’etichetta fluorescente diversa, per visualizzare i modelli sovrapposti dei piani di ghiaccio legati all’AFP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sviluppo del metodo di incisione del ghiaccio da parte di Charles Knight per la determinazione di aerei di ghiaccio legati all’AFP studi molto avanzati sul meccanismo di legame del ghiaccio da parte degli ARP. Mentre le strutture degli ARP potevano essere risolte con la cristallografia a raggi X26,27, non c’era un metodo ovvio per dedurre la superficie complementare sul ghiaccio a cui l’AFP si legava. Quando il tipo I AFP dalla passera d’inverno è stato inizialmente caratterizzato, è stato ipotizzato di lega…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PLD detiene la Canada Research Chair in Ingegneria proteica. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del Canadian Institutes of Health Research alla PLD. Questo lavoro è stato anche supportato da un Grant-in-Aid per la ricerca scientifica della Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (n. 23310171) e del Japan Bio-oriented Technology Research Advancement Institution (BRAIN). Siamo grati ai dottori Chris Marshall e Mike Kuiper per il lavoro pionieristico che ha portato alla FIPA. Siamo anche grati al Dr. Sakae Tsuda per aver fornito strutture per parte di questo lavoro e al Dr. Laurie Graham per aver istituito i filtri per l’eccitazione della luce fluorescente e le emissioni.
Materials
| NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators | Thermo Scientific | RTE7 | |
| Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant | Certified | 29-3037-0 | Common automotive antifreeze |
| Cold finger | not available | not available | Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter) |
| Hemispherical cup | not available | not available | Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter) |
| High Dual Output Lighting System | Lightools Research | LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX | Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research |
| Camera | Canon | EOS 50D | |
| Emission Filters | Lightools Research | LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG | Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens |
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