Proteoom analyse van de cochleaire sensorische epitheel kan een uitdaging vanwege zijn kleine formaat en omdat membraaneiwitten zijn moeilijk te isoleren en te identificeren. Zowel membraan en oplosbare eiwitten kunnen worden geïdentificeerd door meerdere preparatieve methoden en scheidingstechnieken gecombineerd met hoge-resolutie massaspectrometrie.
Proteomics is een veel gebruikte aanpak die inzicht kan geven in complexe biologische systemen. De cochleaire sensorische epitheel bevat receptoren die de mechanische energie van het geluid transduceren in een elektro-chemische energie verwerkt door de perifere en centrale zenuwstelsel. Verschillende proteomische technieken ontwikkeld om het cochleair binnenoor, zoals twee-dimensionale differentiële gel elektroforese (2D-DIGE), antilichaam microarray en massaspectrometrie (MS) te bestuderen. MS is de meest uitgebreide en veelzijdige tool in proteomics en in combinatie met scheidingsmethoden kan een diepgaand proteoom van biologische monsters. Scheidingsmethoden gecombineerd met MS heeft de mogelijkheid te verrijken eiwitmonsters, detecteren lage molecuulgewicht en hydrofobe eiwitten en identificatie lage overvloedige eiwitten doordat het proteoom dynamisch bereik. Verschillende digestie strategieën kunnen worden toegepast op hele lysaat of gefractioneerd eiwit lysaat peptide en eiwitten verbeterensequence dekking. Gebruik van verschillende scheidingstechnieken, zoals sterke kationenwisselaar (SCX), omgekeerde fase (RP), en geëlueerd vloeibare fractie entrapment elektroforese (GELFrEE) kan worden toegepast om de complexiteit monster verminderen voorafgaand aan MS analyse voor proteïne-identificatie.
Proteomics is de studie van complexe biologische systemen door analyse van eiwitexpressie functie modificaties en interacties 1. Verscheidene werkwijzen zijn gebruikt voor proteoomanalyse van het binnenoor, waaronder antilichaam microarray 2, tweedimensionale gelelektroforese 3-5 en DIGE 6. Echter, slechts een beperkt aantal eiwitten geïdentificeerd en gekarakteriseerd 2,7-10, vergeleken met de meer dan 10.000 genen uitgedrukt sequence tags (EST's) die in het binnenoor 11,12, MS is de meest gebruikte techniek en uitgebreide in proteomics voor eiwitkarakterisering. Analyse van complexe proteomics monsters, zoals het slakkenhuis, kan een uitdaging zijn. De combinatie van verschillende scheidingstechnieken MS maakt de identificatie van een groter aantal peptiden en eiwitten, vanwege een verhoogd dynamisch concentratiebereik en piekvermogen 13. Multidimensionale chromatogPHY vermindert zeer complexe eiwitmengsels door het gebruik van verschillende adsorptie mechanismen. Er zijn twee veelgebruikte MS proteoom analyse benadering, shotgun en bottom-up proteomics. In shotgun proteomics, is een mengsel van intacte eiwitten enzymatisch gedigereerd en gescheiden onder toepassing multidimensionale chromatografie met sterke kation-uitwisselingschromatografie (SCX) gevolgd door omgekeerde fase vloeistofchromatografie (RPLC) 14,15. De afgescheiden peptiden worden onderworpen aan tandem MS en gegevensverzamelingzoeken 15. Een groot voordeel van deze techniek is dat duizenden proteïnen kunnen worden geïdentificeerd in een enkele analyse en de techniek beter geschikt voor membraaneiwitten.
In de bottom-up benadering wordt het eiwit mengsel gescheiden, meestal door een-of tweedimensionale elektroforese, en het individuele eiwit banden of vlekken uitgesneden en geknipt met een enzym zoals trypsine, meestal resulterend in meerdere peptiden. Echter, andere recenterly ontwikkeld elektroforetische benadering, gebruikt in een bottom-up proteomics, is GELFrEE. Deze techniek fractioneert eiwitmonsters in vloeibare fase en maakt ze minder complex vóór de analyse. Deze techniek is reproduceerbaar, uitgerust met eiwitterugwinning en vermindert de distributie van high overvloedige proteïnen in complexe eiwitmonsters 16. Peptiden, als gevolg van gescheiden eiwitten, worden geanalyseerd door MS, door gebruik te maken peptidemassa fingerprinting of tandem MS (MS / MS), om sequence tags te creëren voor de database zoeken 17-19. Enkele van de belangrijkste voordelen van het gebruik van de bottom-up benadering zijn de mogelijkheid om hoge-resolutie scheidingen en uitgebreide eiwit dekking te verkrijgen. Bottom-up proteomics is de meest gebruikte techniek proteomics 20 derhalve verscheidene bioinformatica hulpmiddelen beschikbaar. Daarnaast kunnen eiwitten worden gescheiden in een complex mengsel vóór vertering, zodat er een grotere kans op identificatie.
Een van de grote uitdagingenin het gebruik van het binnenoor voor proteomics analyse is het kleine formaat, beperkte toegankelijkheid en celtype diversiteit 21. Bovendien belangrijkste eiwitten die de functionaliteit onderscheiden, zoals ionkanalen, transporters en receptoren, zijn membraaneiwitten, die moeilijk zijn te isoleren 22. Dus kan het filter-aided monstervoorbereiding (FASP) is voordelig voor proteomics analyses van weefsels die zijn beperkt voor eiwitextractie en dat wasmiddelen vereisen om membranen 23 oplosbaar te maken. Deze filtering maakt het MS analyse van membraan en oplosbare eiwitten en op het vermogen om peptiden te isoleren uit laagmoleculaire verontreinigingen 23,24.
Het onderhavige protocol beschrijft gebruikte proteomische benaderingswijzen die worden gecombineerd en aangepast aan zowel oplosbare als membraaneiwitten analyseren en het aantal eiwit ID van cochleaire sensorische epitheel maximaliseren. We zullen beschrijven met behulp shotgun proteomics met FASP multi-verterenion, ionenuitwisselingschromatografie, hoge resolutie MS en gegevensanalyse. Daarnaast zullen we bottom-up proteomics met GELFrEE, FASP multi-spijsvertering, hoge resolutie MS, en data-analyse te beschrijven.
De belangrijkste te maximaliseren eiwit identificatie van de cochleaire sensorische epitheel zijn: 1) gebruik van meerdere endoproteïnases voor de spijsvertering, 2) gebruik van verschillende scheidingstechnieken, en 3) het gebruik van een hoge-resolutie massaspectrometer. De toepassing van verschillende enzymen verhoogt het aantal peptiden en verbetert eiwitsequentie dekking, vandaar verbetering van het aantal geïdentificeerde eiwitten van de cochleaire weefsel. Trypsine, de meest gebruikte protease biedt effic…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken dr. Kent Seeley, directeur van het Center for Drug Discovery en Innovatie (CDDI) Proteomics Core Facility aan de Universiteit van Zuid-Florida voor het gebruik van deze faciliteit. Dit werk werd ondersteund door NIH / NIDCD subsidie R01 DC004295 om BHAS
8% Tris-acetate cartridge | Protein Discovery | 42103 | |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
Acetonitrile | Honeywell | 015-1L | |
AEBSF | Calbiochem | 101500 | |
Ammonium formate | Fisher Scientific | AC16861 | |
Aprotinin | Calbiochem | 616370 | |
ASB-14 | Calbiochem | 182750-5GM | |
Bovine serum albumin | BioRad | 500-0112 | |
C18 column | New Objective | A25112 | 75 μm × 10 cm |
DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | Microplate Assay Protocol |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
Endoproteinase Lys-C | Sigma-Aldrich | P3428 | |
FASP Protein Digestion Kit | Protein Discovery | 44250 | |
Formic acid | Fluka | 94318 | |
GELFrEE Fractionation System | Protein Discovery | 42001 | GELFrEE 8100 |
Leupeptin | Calbiochem | 108975 | |
MacroSpin Column | The Nest Group | SMM SS18V | Silica C18 |
Microcystin | Calbiochem | 475815 | |
Pepstatin | Sigma-Aldrich | P5318 | |
Polysulfoethyl A Column | The Nest Group | 202SE0503 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Sonic Dismembrator | Thermo Fisher | 15-338-53 | Model 100 |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T6567 | Proteomics Grade |