Bottom-up og Shotgun Proteomikk å identifisere en omfattende Cochlea Proteome

Summary

Proteom analyse av cochlea sensorisk epitel kan være utfordrende på grunn av sin lille størrelse og fordi membran proteiner er vanskelige å isolere og identifisere. Både membran og oppløselige proteiner kan identifiseres ved å kombinere flere preparative metoder og separasjonsteknikker sammen med høy-oppløsningsmassespektroskopi.

Abstract

Proteomikk er en vanlig brukt metode som kan gi innsikt i komplekse biologiske systemer. Den cochlea sensorisk epitel inneholder reseptorer som transduce den mekaniske energien til lyd i en elektro-kjemisk energi som behandles av det perifere og sentrale nervesystem. Flere proteomic teknikker har blitt utviklet for å studere cochlea indre øret, slik som to-dimensjonale forskjell gelelektroforese (2D-DIGE), antistoff microarray, og massespektrometri (MS). MS er den mest omfattende og allsidig verktøy i proteomikk og i forbindelse med separasjonsmetoder kan gi en grundig proteomet av biologiske prøver. Separasjons metoder kombinert med MS har evnen til å berike proteinprøver, detektere lav molekylvekt og hydrofobe proteiner, og identifisere lave tallrike proteiner ved å redusere proteomet dynamisk område. Forskjellige fordøyelse strategier kan bli anvendt for å hel-lysat eller fraksjonert protein lysatet for å øke peptid-og proteinsekvens dekning. Utnyttelse av forskjellige separasjonsteknikker, inkludert sterk kationbytter (SCX), reversfase (RP), og gel-eluert væskefraksjon innesperring elektroforese (GELFrEE) kan anvendes for å redusere kompleksiteten prøven før MS-analyse for protein identifikasjon.

Introduction

Proteomikk er studiet av kompliserte biologiske systemer ved å analysere proteinekspresjon, funksjon, modifikasjoner, og interaksjoner ^en. Flere metoder er blitt anvendt for proteom analyse av det indre øret, inkludert antistoffer microarray ^2, to-dimensjonal gelelektroforese ^3-5, og DIGE ^6.. Men, har blitt identifisert og karakterisert ^2,7-10, sammenlignet med over 10 000 gener og uttrykt sekvens tags (samle såkalte) identifiserte i det indre øret ^11,12 bare et begrenset antall proteiner, er MS den mest brukte og omfattende teknikk i proteomikk for protein karakterisering. Analyse av komplekse proteomikk prøver, slik som i sneglehuset, kan være utfordrende. Imidlertid er kombinasjonen av flere separasjonsteknikker med MS muliggjør identifisering av et større antall av peptider og proteiner, på grunn av en økt dynamisk konsentrasjonsområde og maksimal kapasitet ^13.. Flerdimensjonal kromatografiPHY reduserer svært komplekse proteinblandinger ved å tillate bruk av forskjellige adsorpsjon mekanismer. Det finnes to vanlige MS proteom analyse tilnærminger, hagle og bottom-up proteomikk. I shotgun proteomforskning, er en blanding av intakte proteiner enzymatisk spaltet og separert ved hjelp av flerdimensjonal kromatografi med sterk kation-byttekromatografi (SCX), etterfulgt av reversfase-væskekromatografi (Bytt ut) ^14,15. De separerte peptider er utsatt for tandem MS og databasesøk ^15.. En stor fordel med denne teknikken er at tusener av proteiner kan bli identifisert i en enkel analyse, og teknikken er bedre egnet til membranproteiner.

I den opp-ned-metode, blir proteinblandingen separeres, vanligvis ved en-eller todimensjonal elektroforese, og de enkelte proteinbånd eller flekker skåret ut og fordøyd med et enzym slik som trypsin, vanligvis resulterer i flere peptider. Men en annen nyerely utviklet elektro tilnærming, som brukes i bottom-up proteomikk, er GELFrEE. Denne teknikken fraksjonerer proteinprøver i væskefase og gjør dem mindre kompleks før analyse. Denne teknikken er reproduserbar, tilbyr høy protein utvinning, og reduserer fordelingen av høye rikelig proteiner i komplekse proteinprøver ^16. Peptides, som følge av separerte proteinene blir analysert ved MS, ved hjelp av peptid-masse fingerprinting eller tandem MS (MS / MS), for å opprette sekvensen koder for database søker ^17-19. Noen av de store fordelene med å bruke bottom-up tilnærming er muligheten til å få høyoppløselige separasjoner og omfattende protein dekning. Bottom-up proteomikk er den mest brukte teknikken i proteomikk ^20, derav flere bioinformatikk verktøy er tilgjengelige. I tillegg kan proteinene bli separert i en kompleks blanding før fordøyelse, slik at det er større sannsynlighet for identifikasjon.

En av de store utfordringenei å bruke det indre øret for proteomikk analyser er dens liten størrelse, begrenset tilgjengelighet, og celletype mangfold ^21. I tillegg er viktige proteiner som skiller dens funksjonalitet, slik som ionekanaler, transportører og reseptorer, er membranproteiner, som kan være vanskelig å isolere ^22. Dermed er filter assistert prøveopparbeidelse (FASP) fordelaktig for proteomikk analyser av vev som er begrenset for protein utvinning og som krever vaskemidler til å oppløse membraner ^23. Denne filtreringen gjør det mulig for MS-analyse av membran-og oppløselige proteiner, og for evnen til å isolere peptider fra lavmolekylære forurensninger ^23,24.

Den nåværende protokollen beskriver brukte proteomikk tilnærminger som er kombinert og modifisering for å analysere både løselig og membran proteiner og å maksimere antallet protein IDer fra cochlea sensorisk epitel. Vi vil beskrive med hagle proteomikk med FASP multi-fordøyeion, ionebytterkromatografi, høy oppløsning MS, og dataanalyse. I tillegg vil vi beskrive bottom-up proteomikk med GELFrEE, FASP multi-fordøyelsen, høyoppløselig MS, og dataanalyse.

Protocol

Etikk Erklæring Eksperimenter med mus vev ble godkjent av University of South Florida Institutional Animal Care og bruk Committee (Protokoller 3931R, 3482R) som angitt i henhold til retningslinjene av National Institutes of Health. En. Protein Extraction Isoler cochlea sensorisk epitel fra 16 30 dager gamle (P30) CBA / J mus og oppbevar ved -80 ° C. På dagen for eksperimentet, vaskes vevet med 500 ul av 1 x fosfatbufret saltvann (PBS). Sentri…

Representative Results

For å få mest mulig dekkende proteomet av cochlea sensorisk epitel, er raskt vev disseksjon nødvendig før protein ekstraksjon og prøveopparbeidelse. To proteomikk teknikker kan brukes, hagle og bottom-up proteomikk. For å fremstille prøver for shotgun proteomforskning ble FASP oppslutningsprosedyre anvendes som illustrert i figur 1.. Den FASP Metoden tillater konsentrasjon av proteiner, fjerning av vaske-og rengjøringsmidler, og fordøyelse av proteiner ved hjelp av flere enzymer. Det var to dob…

Discussion

De viktigste fremgangsmåten for å maksimere protein identifikasjon av cochlea sensorisk epitel er: 1) bruk av flere endoproteinases for fordøyelsen, 2) bruken av flere separasjonsteknikker, og 3) bruk av en høy-oppløsnings masse-spektrometer. Anvendelsen av flere enzymer øker antallet peptider og forbedrer proteinsekvens dekning, og dermed øke antall identifiserte proteiner fra sneglehuset vev. Trypsin, den mest brukte protease gir effektiv og spesifikk spalting av proteiner, genererer peptider som er bra f…

Materials

8% Tris-acetate cartridge	Protein Discovery	42103
Acetone	Sigma-Aldrich	179124
Acetonitrile	Honeywell	015-1L
AEBSF	Calbiochem	101500
Ammonium formate	Fisher Scientific	AC16861
Aprotinin	Calbiochem	616370
ASB-14	Calbiochem	182750-5GM
Bovine serum albumin	BioRad	500-0112
C18 column	New Objective	A25112	75 μm × 10 cm
DC Protein Assay	BioRad	500-0116	Microplate Assay Protocol
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Endoproteinase Lys-C	Sigma-Aldrich	P3428
FASP Protein Digestion Kit	Protein Discovery	44250
Formic acid	Fluka	94318
GELFrEE Fractionation System	Protein Discovery	42001	GELFrEE 8100
Leupeptin	Calbiochem	108975
MacroSpin Column	The Nest Group	SMM SS18V	Silica C18
Microcystin	Calbiochem	475815
Pepstatin	Sigma-Aldrich	P5318
Polysulfoethyl A Column	The Nest Group	202SE0503
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Sonic Dismembrator	Thermo Fisher	15-338-53	Model 100
Trypsin	Sigma-Aldrich	T6567	Proteomics Grade