Visualisation neuroblaste Cytocinèse cours<em> C. elegans</em> Embryogenèse
Summary
Ce protocole décrit comment l'image des cellules en division dans un tissu en Caenorhabditis elegans embryons. Bien que de nombreux protocoles décrivent comment la division cellulaire de l'image dans l'embryon précoce, ce protocole décrit comment l'image de la division cellulaire dans un tissu en développement au cours de l'embryogenèse tardive milieu.
Abstract
Ce protocole décrit l'utilisation de la microscopie de fluorescence à l'image à l'intérieur de la division des cellules en développement Caenorhabditis elegans embryons. En particulier, ce protocole met l'accent sur la façon de l'image divisant neuroblastes, qui se trouvent sous les cellules de l'épiderme et peuvent être importants pour la morphogenèse épidermique. formation de tissus est cruciale pour le développement de métazoaires et s'appuie sur des indices externes de tissus voisins. C. elegans est un excellent organisme modèle pour étudier la morphogenèse des tissus in vivo en raison de sa transparence et de l'organisation simple, faire ses tissus faciles à étudier par microscopie. Enceinte ventrale est le processus où la surface ventrale de l'embryon est recouvert d'une seule couche de cellules épithéliales. Cet événement est pensé pour être facilitée par les neuroblastes sous-jacents, qui fournissent orientation chimique indices de médiation migration des cellules épithéliales recouvrant. Toutefois, les neuroblastes sont très proliférante et peuvent également agircomme substrat mécanique pour les cellules épidermiques ventrales. Les études utilisant ce protocole expérimental pourraient découvrir l'importance de la communication intercellulaire pendant la formation du tissu, et pourraient être utilisées pour révéler les rôles des gènes impliqués dans la division cellulaire dans les tissus en développement.
Introduction
Bien qu'il existe des protocoles décrivant la manière de la division cellulaire de l'image au début C. elegans embryon, ce protocole décrit comment la division cellulaire de l'image dans un tissu à la mi embryogenèse. L'un des principaux défis dans les organismes d'imagerie au cours du développement a été leur sensibilité à la phototoxicité. Cependant, l'augmentation de l'accessibilité à la filature microscopes confocaux disque ou microscopes champ balayé a permis des applications d'imagerie les plus répandues. Les deux systèmes utilisent des lasers à l'état solide et la lumière diffusée, ce qui limite les niveaux de rayons UV que les organismes sont exposés. Toutefois, les peuplements Widefield peuvent encore être utilisés pour l'imagerie in vivo, en particulier s'ils sont équipés de caméras à haute sensibilité (par exemple EMCCD), le contrôle de l'ouverture et contrôle de la lumière (par exemple des LED ou des ampoules de mercure réglables). Ce protocole décrit comment utiliser soit un système confocal base ou un système à grand champ de la division cellulaire de l'image dans le développement C. elegans </ Em> embryons. A titre d'exemple, nous décrivons comment l'image de la division cellulaire des neuroblastes. Neuroblastes peuvent faciliter la morphogenèse épidermique en fournissant des signaux chimiques ou mécaniques pour les cellules de l'épiderme sus-jacentes, et de fournir un excellent exemple de l'importance de la communication intercellulaire dans la formation des tissus.
Caenorhabditis elegans est un organisme modèle idéal pour les études fondées microscopie en raison de sa transparence et de l'organisation simple tissu 1. Par ailleurs, C. elegans se prête à des méthodes génétiques et RNAi, et puisque plusieurs de ses gènes ont des homologues humains, il peut être utilisé pour identifier les mécanismes conservées pour la formation de tissu 2-5. Dans C. elegans, la formation de l'épiderme survient pendant l'embryogenèse milieu, quand l'embryon a> 300 cellules. Morphogenèse épidermique se compose de plusieurs phases principales, au cours de laquelle l'embryon est enfermé dans une couche de cellules épidermiques qui compriment et s'étendent à transformer le embryo d'une forme ovoïde dans la forme allongée d'un ver 6. Décrit une enceinte ventrale de ces événements morphogénétiques, lorsque les cellules épidermiques ventrales migrent vers la ligne médiane ventrale à couvrir la surface ventrale de l'embryon (figure 1). Tout d'abord, deux paires de cellules de premier plan de bord antérieure située migrent vers la ligne médiane ventrale, où elles adhèrent et fusionnent avec leurs voisins controlatérales 6. Elle est suivie par la migration des cellules de poche postérieure situé, qui forment coin comme des formes en créant une poche ventrale 6-7. Le mécanisme qui ferme la poche n'est pas bien comprise. Une possibilité est que la structure de la myosine contractile actine supracellular lie les cellules de poche ensemble dans une chaîne de sac à main comme la mode, semblable à la cicatrisation des plaies 8. Fait intéressant, la migration d'une partie des cellules de la poche est médiée par des sous-ensembles spécifiques de sous-jacents 9 neuroblastes (précurseurs neuronaux qui se trouvent en dessous de la epidermis, figure 1B).
Des études antérieures ont montré que les neuroblastes régulent la migration ventrale des cellules épidermiques et de l'enceinte ventral. VAB-1 (récepteur Ephrin) et (ligand Ephrin) VAB-2 est fortement exprimé dans les neuroblastes et faciliter le tri des antérieur et neuroblastes postérieures les unes des autres, et mutations dans VAB-1 ou VAB-2 provoquent enceinte ventrale phénotypes 10-13. Cependant, les expériences de sauvetage de promoteurs ont montré que VAB-1 est également nécessaire dans les cellules épidermiques ventrales jacentes et des récepteurs pour d'autres signaux de guidage sécrétées par les neuroblastes sont exprimés dans les cellules de l'épiderme ventral 9. Bien que des mutations dans l'un de ces récepteurs provoquent phénotypes de l'enceinte ventrales, il n'est pas clair si les défauts se produisent en raison de problèmes de positionnement des neuroblastes ou en raison de l'échec des cellules épidermiques ventrales pour répondre aux signaux de guidage 14. Modification de la répartition des neuroblastes wiThoout affectant leur capacité à sécréter des signaux de guidage pourrait faire la lumière sur le rôle des neuroblastes et leur capacité à apporter une contribution mécanique au cours de la morphogenèse épidermique. Récemment, il a été constaté qu'un gène de la division cellulaire, ani-1 (anillin) est fortement exprimé dans les neuroblastes (figure 2A) et son appauvrissement provoque neuroblastes défauts de division. Fait intéressant, ces embryons présentent ventrales phénotypes de l'enceinte (Fotopoulos, Wernike et Piekny, observations non publiées).
Anillin est requis pour la division cellulaire, et en particulier pour la cytokinèse, qui décrit le processus par lequel une cellule mère sépare physiquement en deux cellules filles. Cytocinèse est entraîné par la formation d'un anneau contractile actomyosine, qui doit être étroitement contrôlée dans l'espace et le temps pour s'assurer qu'il est correctement couplée avec la sœur de chromatides ségrégation. Le régulateur principal de la cytokinèse métazoaires est RhoA (RHO-1 chez C. elegans), une petite GTPase qui est unctive dans sa forme liée au GTP. La FEM Ect2/ECT-2 RhoA active, après quoi interagit RhoA-GTP avec des effecteurs en aval, qui forment l'anneau contractile et la médiation de son l'admission 15. Anillin est une protéine de domaine qui se lie à plusieurs RhoA via son extrémité C-terminale et à l'actine et de la myosine par l'intermédiaire de son extrémité N-terminale. Anillin est nécessaire pour stabiliser la position de l'anneau contractile dans des cellules de mammifères ou de Drosophila S2 16. Anillin épuisement provoque des anneaux contractiles à des oscillations latérales, et la cytokinèse échoue finalement former des cellules multinucléées 17-19. Fait intéressant, bien que C. elegans ani-1 coordonne actomyosin contractilité dans l'embryon précoce, il n'est pas essentiel pour la cytokinèse. Cependant, comme décrit ci-dessus, ani-1 est requise pour la cytokinèse neuroblastes durant l'embryogenèse (mi-Fotopoulos, Wernike et Piekny, observations non publiées). l'échec de la cytokinèse modifierait le nombre et la position des neuroblastes et pourrait affecter la loction de signaux de guidage chimiques, ou il peut modifier les propriétés mécaniques du tissu. Les deux modèles mettent en évidence le rôle non autonome de neuroblastes pour enceinte ventrale, et l'importance de la communication tissus tissus au cours du développement embryonnaire.
Ce protocole expérimental décrit comment la division cellulaire de l'image pendant C. elegans mi embryogenèse en utilisant la microscopie de fluorescence. La majorité des expériences qui étudient les mécanismes de la division cellulaire ont été réalisées dans des cellules individuelles dans des boîtes de culture (par exemple. Des cellules HeLa ou S2) ou dans les embryons précoces avec un nombre limité de cellules (par exemple C. elegans embryon d'une cellule, Xenopus, ou échinoderme embryons). Cependant, il est également important d'étudier la division cellulaire dans les tissus, car il existe des indices externes qui peuvent influer sur la synchronisation et la mise en place du plan de division. En outre, les cellules peuvent fournir des indices chimiques ou mécaniques d'influencer le développement du tissu voisins, et il est important de comprendre comment la communication intercellulaire aide tissus pour former au cours du développement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit l'utilisation de divers types de microscopie à des divisions cellulaires de l'image au cours de l'embryogenèse milieu. En particulier, ce protocole met en évidence comment l'image de la division des neuroblastes, des cellules qui peuvent faciliter la morphogenèse épidermique. La communication cellulaire est important pour la formation des tissus au cours du développement de métazoaires et C. elegans est un excellent modèle pour étudier la formation du tissu in v…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à reconnaître que ce travail a été soutenu par le Conseil de recherches en génie du Canada de subvention (CRSNG) en sciences naturelles et.
Materials
| Agar | BioShop Canada Inc. | #AGR001.1 | For making C. elegans NGM and RNAi plates |
| Agar | Bio Basic Inc. | #9002-18-0 | For making bacteria LB agar plates |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | #AGA001.500 | |
| Anti-mouse Alexa 488 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11029 | |
| Anti-mouse anti-GFP antibody | Roche Applied Science | #11814460001 | |
| Anti-rabbit Alexa 568 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11011 | |
| Ampicillin | BioShop Canada Inc. | #AMP201.5 | Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C |
| Bactopetone (peptone-A) | Bio Basic Inc. | #G213 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | BioShop Canada Inc. | #C302.1 | |
| Cholesterol | BioShop Canada Inc. | #CHL380.25 | Dissolve in ethanol |
| DAPI | Sigma-Aldrich | #D9542 | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Glycerol | BioShop Canada Inc. | #GLY001.1 | |
| IPTG (isopropylthio-β-galactoside) | Bio Basic Inc. | #367-93-1 | Store powder and dissolved IPTG at -20 °C |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | BioShop Canada Inc. | #PPM666.1 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | BioShop Canada Inc. | #PPD303.1 | |
| L4440 (feeding vector) | Addgene | #1654 | Keep as glycerol stock at -80 °C |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | BioShop Canada Inc. | #MAG511.500 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | #7647-14-5 | |
| Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | #7558-79-4 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Wisent Bioproducts | #035-110 | |
| n-propyl 3.4.5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) | Alfa Aesar | #A10877 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | #P8920 | For optimal results coat microscope slides three times |
| Streptomycin | BioShop Canada Inc. | #STP101.50 | Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C |
| Tetracyclin | BioShop Canada Inc. | #TET701.10 | Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C |
| Tween-20 | Bio Basic Inc. | CAS#9005-64-5 | |
| Tryptone | BioShop Canada Inc. | #TRP402.500 | |
| Yeast Extract | Bio Basic Inc. | #8013-01-2 |
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