Bedöma utvecklingen av murina plasmacytoid dendritiska celler i Peyers Patches Använda adoptiv överföring av hematopoetiska stamfäder
Summary
Detta protokoll beskriver experimentella metoder för att utvärdera differentiering av plasmacytoid dendritiska celler i Peyer s patch från vanliga dendritiska celler föregångare, med hjälp av tekniker som involverar FACS-medierad cellisolering, hydrodynamisk genöverföring, och flödesanalys av immunundergrupper i Peyer s patch.
Abstract
Detta protokoll specificerar en metod för att analysera förmågan hos renade hematopoietiska föregångare för att alstra plasmacytoid dendritiska celler (PDC) i intestinal Peyers plaque (PP). Vanliga dendritcellsprekursorer progenitorer (CDPS, Lin – c-kit-lo CD115 + Flt3 +) renades från benmärgen hos C57BL6 möss med FACS och överföras till mottagande möss som saknar en betydande pDC befolkningen i PP, i detta fall, IFNAR – / – möss användes som överföringsmottagare. I vissa möss, var överuttryck av den dendritiska celltillväxtfaktör Flt3 ligand (Flt3L) verkställts före adoptiv överföring av CDPs, använda hydrodynamiska genöverföring (HGT) i Flt3L-kodning plasmid. Flt3L uttryck expanderar DC populationer med ursprung från förts (eller endogena) hematopoetiska stamceller. Vid 7-10 dagar efter stamfader överföring, var pDCs som uppstår från de adoptivt överförda stamceller skiljer sig från mottagande celler pågrundval av CD45 markör uttryck, med pDCs från överförda CDPs vara CD45.1 + och mottagare är CD45.2 +. Förmågan hos överförda CDPs att bidra till PDC befolkningen i PP och att svara på Flt3L utvärderades genom flödescytometri av PP enkelcellsuspensioner från mottagande möss. Denna metod kan användas för att testa om andra gångarpopulationer kan generera PP pDCs. Dessutom kan denna metod användas för att undersöka betydelsen av faktorer som förutspås påverka pDC utveckling i PP, genom att överföra stamceller undergrupper med lämplig knockdown, knockout eller överuttryck av den förmodade utvecklingsfaktor och / eller genom att manipulera cirkulerande cytokiner via HGT . Denna metod kan också möjliggöra analys av hur PP pDCs påverka frekvensen eller funktionen av andra immunundergrupper i PP. Unikt för denna metod är att använda IFNAR – / – möss, som visar allvarligt utarmat PP pDCs relativt vild typ djur, alltså allowing rekonstitution av PP pDCs i frånvaro av störeffekter från dödlig bestrålning.
Introduction
Här visar vi ett protokoll för att bedöma om gemensamma dendritiska celler stamceller (CDPs) kan ge upphov till plasmacytoid dendritiska celler (PDC) befolkningen i Peyer s patch (PP). Det övergripande målet med denna metod var att utvärdera utvecklings regleringen av pDCs i Peyers plaque (PP pDCs). Anledningen till att detta är viktigt är att PP pDCs skilja från pDCs funna i andra vävnader inklusive benmärg, blod och mjälte, och det är därför oklart om PP pDCs och andra PDC-populationer är utvecklingsmässigt och / eller funktionellt besläktade. Specifikt är pDCs allmänt känd för att vara den huvudsakliga typ I interferon (IFN) producenterna inom det hematopoetiska systemet, svara på Toll-like receptor 7 och 9 (TLR7 / 9) stimulering av snabb IFN sekre 1-3. Men PP pDCs har brist på produktion av typ I IFN svar på TLR-agonist stimulering 4,5. Dessutom PP pDCs skiljer sig också från pDCs som finns i benmärg och mjälte ikräver signaler från typ I interferon (IFN)-receptorn (IFNAR1) eller IFN signalmolekyl STAT1 för deras utveckling och / eller ackumulering 5. Dessa data tyder på möjligheten att olika regleringsmekanismer styr PP pDCs kontra pDCs i andra organ (t.ex. benmärg, mjälte) 5.
Den logiska grunden som ledde till utvecklingen av den här metoden var baserad på de senaste framstegen inom förstå dendritiska celler (DC) biologi. De flesta, om inte alla, DC delmängder härrör från hematopoetiska stamceller som uttrycker den FMS-liknande tyrosinkinas 3-receptor (Flt3) 6-10, dock är DC utveckling inte begränsad till den klassiska myeloida och lymfoida vägar. Exempelvis FLT3 + vanliga myeloida stamceller (CMPS, lin – IL-7R – Sca-1 – c-kit + CD34 + FcyR lo / -) ger upphov till CDPs (lin – c-kit lo CD115 + Flt3 +), which ytterligare differentiera till pDCs och konventionella DC (CDCs) 9,10. Däremot Flt3 + gemensamma lymfoida stamceller (CLPS, lin – IL-7R + Sca-1 lo c-kit lo) i första hand utvecklas till pDCs 11. Därför tidigare studier indikerar pDCs uppstår från minst 2 distinkta hematopoetiska progenitorceller populationer under regleringen av Flt3L, även om den typiska analysen har begränsats till benmärgen, mjälten och / eller blod PDC undergrupper. Således föregångare befolkningen (er) som genererar PP pDCs krävs utredning. Att förstå ursprunget till PP pDCs kommer att belysa om de har gemensamma utvecklingsvägar med andra PDC populationer, eller använda olika mekanismer under sin generation i PP.
En unik fördel med den metod som beskrivs här är att använda möss som visar en allvarlig brist i PP pDCs som mottagare för adoptiv överföring av hematopoetiska stamceller. Möss med gentic deletion i genen som kodar för IFNAR1 (IFNAR – / – möss) eller STAT1 (Stat1 – / -) avslöjade en slående tömning i PP pDCs 5. Därför är dessa stammar ger en miljö där PP pDCs minskar, vilket gör att adoptiv överföring studier som ska utföras i frånvaro av potenta cell ablation regimer som dödlig strålning. Ytterligare en styrka med metoden som presenteras här är användningen av hydrodynamiska genöverföring (HGT) för att stimulera förhöjda cirkulerande mängder Flt3L. Detta ger en kostnadseffektiv metod för att framkalla Flt3L in vivo, jämfört med injektion av rekombinant protein. Ett flertal studier, bland annat i vårt labb, har anställt HGT att inducera cytokin belopp i en mängd olika experimentella betingelser 5,12,13.
Arbetsfördelningen och exakta immunfunktioner för DC är av stort intresse för immunologi. Särskilt pDCs är viktiga förmedlare av oral tolerans och systemisk anti-virus-svar, men de verkar även bidra till utvecklingen och persistens av autoimmunitet och cancer 14-17. Protokollet som beskrivs här gör det möjligt för utvecklings mekanismer som reglerar PP pDCs att vara mer till fullo. Dessutom kan denna strategi att studier för att bedöma PP PDC-funktionen, och kan utvidgas till att förstå reglering och funktion av andra immun populationer inom PPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den adoptiv överföring teknik som beskrivs häri utvärderas bidraget av CDPs till PP pDC befolkningen i mottagarmöss som har brist på PP pDCs (t.ex. IFNAR – / – möss). I framtida experiment, är det viktigt att utvärdera potentialen av andra gångargrupper generera PP pDCs, särskilt huruvida PP pDCs härrör från FLT3 + CLPS. Denna fråga är viktig eftersom det är fortfarande oklart varför PP pDCs är unikt känsliga för IFNAR-STAT1 signaler för PP periodiserad 5, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Alex Gelbard och Willem Overwijk för råd om hydrodynamisk genöverföring. Detta arbete har finansierats med bidrag från NIH (AI098099, SSV), MD Anderson Center for Cancer Epigenetik, MD Anderson Centrum för inflammation och cancer (SSV), och RE Bob Smith Education Fund (HSL).
Materials
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10XHBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat ant-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
- Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 .
- Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood. Science. 284 (5421), 1835-1837 .
- Asselin-Paturel, C., et al. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 .
- Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. Cutting edge: Peyer’s patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype. J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).
- Li, H. S., et al. Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response. Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).
- D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 .
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 .
- Liu, K., et al. In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. 8 (11), 1217-1226 .
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121 (1), 11-19 .
- Hirai, H., et al. C/EBPbeta is required for ’emergency’ granulopoiesis. Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).
- Overwijk, W. W., et al. Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant. J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).
- Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).
- Goubier, A., et al. Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance. Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Sci. Transl. Med. 3 (73), .
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Blasius, A. L., et al. Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation. J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).
- Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective. Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).
