Analyserer kraniofacial Morfogenese i zebrafisk Brug 4D konfokal mikroskopi
Summary
Time-lapse konfokal billeddannelse er en kraftfuld teknik nyttig til karakterisering af fosterudviklingen. Her beskriver vi den metode og karakterisere kraniofaciale morfogenese i vildtype, samt PDGFRA, smad5, og SMO mutant embryoner.
Abstract
Time-lapse-billeddannelse er en teknik, der giver mulighed for direkte observation af processen morfogenese eller generering af form. På grund af deres optiske klarhed og modtagelighed for genetisk manipulation, er zebrafisk embryo blevet en populær model organisme med at udføre time-lapse-analyse af morfogenese i levende fostre. Konfokal afbildning af en levende zebrafisk embryo kræver, at et væv af interesse vedvarende er mærket med en fluorescerende markør, såsom et transgen eller injiceres farvestof. Processen kræver, at fosteret er bedøvet, og holdes på plads på en sådan måde, at en sund udvikling forløber normalt. Parametre for billeddannelse skal indstilles til at redegøre for tre-dimensionelle vækst og at skabe balance mellem krav redde individuelle celler, mens få hurtige snapshots af udvikling. Vores resultater viser evnen til at udføre langsigtede in vivo billeddannelse af fluorescens-mærket zebrafisk embryoner og opdage varierede væv adfærd ikranie neurale våbenskjold, der forårsager kraniofaciale abnormiteter. Udviklingsmæssige forsinkelser forårsaget af anæstesi og montering er minimal, og embryoner er uskadt ved processen. Time-lapse filmede embryoner kan returneres til flydende medium og efterfølgende filmede eller fast på senere punkter i udvikling. Med en stigende overflod af transgene zebrafisk linjer og velkarakteriseret skæbne kortlægning og transplantationscentre teknikker, billedbehandling enhver ønsket væv er mulig. Som sådan time-lapse in vivo imaging kombinerer kraftigt med zebrafisk genetiske metoder, herunder analyser af mutant og mikroinjicerede embryoner.
Introduction
Craniofacial morfogenese er en kompleks multi-trins proces, der kræver en koordineret interaktioner mellem flere celletyper. Størstedelen af kraniofaciale skelet er afledt fra neurale kamceller skal hvoraf mange migrerer fra den dorsale neuralrøret i forbigående strukturer kaldet svælg buer 1. Som med mange væv, morfogenese af kraniofaciale skelet er mere kompliceret, end der kan forstås af statiske billeder af fostre på bestemte udviklingsmæssige tidspunkter. Selv om det er tidskrævende at udføre in vivo time-lapse mikroskopi giver en kontinuerlig kig på en fosterets udvikling celler og væv. Hvert billede i en time-lapse-serie giver sammenhæng til de andre, og hjælper en investigator bevægelse mod at udlede, hvorfor et fænomen snarere end at udlede, hvad der sker på det tidspunkt.
In vivo billeddannelse er således en kraftfuld beskrivende værktøj til eksperimentelle tilgange tildekonstruere de veje, der styrer morfogenese. Zebrafisk Danio rerio er en populær genetisk model af hvirveldyr embryonale udvikling, og er særdeles velegnet til in vivo billeddannelse af morfogenese. Moderne, er bekvemme metoder til gensplejsning og genomisk modifikation hurtigt fremme antallet af tilgængelige værktøjer til zebrafisk forskere. Disse værktøjer forbedre allerede robuste metoder til genetisk manipulation og mikroskopi. In vivo billeddannelse af næsten enhver væv i næsten enhver ønsket genetisk sammenhæng er tættere på virkeligheden end fantasien.
Morfogenetiske bevægelser af svælg buer er styret af signalering interaktioner mellem neurale våbenskjold og den tilstødende epithel, både ectoderm og endoderm. Der er talrige signalmolekyler udtrykkes af epitelet, der er nødvendige for at drive morfogenese kraniofaciale skelet elementer. Blandt disse signalmolekyler, Sonic Hedgehog (Shh) er kritisk vigtigt feller kraniofaciale udvikling 2-8. Shh udtrykkes ved både den mundtlige ectoderm og svælg endoderm 2,6,9,10. Udtrykket af Shh i endodermen regulerer morfogenetiske bevægelser af buer 10, mønstret af neural crest inden buer 10, og væksten i den kraniofaciale skelet 11.
BMP signalering er også kritisk vigtigt for kraniofacial udvikling 12 og kan ændre morfogenese af svælg buer. BMP signalering regulerer dorsale / ventrale mønstret af våbenskjold i svælg buer 13,14. Forstyrrelser i smad5 i zebrafisk forårsager alvorlige palatinalt fejl og en fejl i Meckel s brusk til at smelte ordentligt på midterlinjen 15. Desuden mutanterne også vise reduktioner og fusion i ventrale brusk elementer, med 2., 3., og undertiden 4. buen elementer fusioneret på midterlinjen 15. Disse fusioner tyder stærkt på, at BMP signalering dirigerer morfogenese af disse svælg elementer.
PDGF signalering er nødvendig for kraniofaciale udvikling, men har ukendte roller i buen morfogenese. Både mus og zebrafisk PDGFRA mutanter har dyb midfacial clefting 16-18. I hvert fald i zebrafisk denne midfacial clefting skyldes en fejl i ordentlig neural crest cellemigration 16. Neuralkam celler fortsætter med at udtrykke PDGFRA efter at de har indtastet svælg buer. Derudover er PDGF-ligander udtrykt ved ansigts epiteler og inden svælg buer 16,19,20, således PDGF signalering kunne også spille en rolle i morfogenese af svælg buer efter migration. Men analyser af morfogenese af svælg buer i PDGFRA mutanter er ikke blevet udført.
Her viser vi in vivo konfokal mikroskopi af pharyngulet-trins transgene zebrafisk og beskrive morfogenese af svælg buer inden for denne periode. Vi yderligere at demonstrere væv adfærd, der er påvirket af mutationer, der forstyrrer BMP, PDGF og Shh signalveje.
Protocol
Representative Results
Discussion
Time-lapse konfokal mikroskopi er et kraftfuldt værktøj til analyse af udviklingen. Her vil vi vise metodens anvendelighed i at studere buen morfogenese i zebrafisk, der er mutant for vigtige signalveje ved hjælp af et transgen, som mærker neurale crest celler. Ud til tissue-niveau analyser, tid bortfalder analyser gælder også for analyser på et cellulært skala 28. Mange udbredte zebrafisk metoder kan også indarbejdes i time-lapse mikroskopi eksperimenter, herunder mikroinjektion af morpholinos, mRNA…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Melissa Griffin og Jenna Rozacky for deres ekspert fisk pleje. PDM tak EGN til at skrive hjælp, generøsitet og tålmodighed. Dette arbejde blev støttet af NIH / NIDCR R01DE020884 til JKE.
Materials
| 6 lb. test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscope cover glass, 22×22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Microscope cover glass, 24×60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |
References
- Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution. Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Roessler, E., et al. Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly. Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).
- Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia. Genes Dev. 18, 937-951 (2004).
- Hu, D., Marcucio, R. S. A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm. Development. 136, 107-116 (2009).
- Cordero, D., et al. Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes. J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).
- Westphal, H., Beachyr, P. A. Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature. 383, 3 (1996).
- Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs. Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).
- Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton. Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).
- Balczerski, B., et al. Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors. Dev. Biol. , (2011).
- Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).
- Alexander, C., et al. Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton. Development. 138, 5135-5146 (2011).
- Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton. Development. 138, 5147-5156 (2011).
- Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).
- Soriano, P. The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites. Development. 124, 2691-2700 (1997).
- Tallquist, M. D., Soriano, P. Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells. Development. 130, 507-518 (2003).
- Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells. Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).
- Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development. Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches. PloS one. 8, e59533 (2013).
- Varga, Z. M., et al. Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation. Development. 128, 3497-3509 (2001).
- Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio. 1, 46-53 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning. Development. 131, 5703-5716 (2004).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).
