Isolering af Double Negative αβ T-celler fra nyren
Summary
DNabT celler er sjælden blandt perifere T-celler; men de er meget hyppig i ikke-lymfoide væv. Vanskeligheden ved at isolere DN T-celler fra ikke-lymfoide væv hindrer deres funktionelle analyse trods stigende anerkendt patofysiologisk betydning. Vi beskriver en roman protokol til isolering af højrensede DN T-celler fra murine nyre.
Abstract
Der er i øjeblikket ingen standard-protokol til isolering af DN T-celler fra de ikke-lymfevæv trods deres stigende rapporteret involvering i forskellige immunreaktioner. DN-T-celler er en unik immuncelle type, der har været impliceret i regulering af immun-og autoimmune reaktioner og tolerance over for allotransplants 1-6. DN T-celler er dog sjælden i perifert blod og sekundære lymfoide organer (milt og lymfeknuder), men er vigtige beboere i den normale nyre. Meget lidt er kendt om deres patofysiologiske funktion 7 på grund af deres mangel på periferien. Vi har for nylig beskrevet en omfattende fænotypisk og funktionel analyse af denne befolkning i nyrerne 8 i steady state og under iskæmi reperfusionsskade. Analyse af DN T-celle funktion vil blive øget væsentligt ved at udvikle en protokol for deres isolation fra nyren.
Her beskriver vi en ny protokol, der tillader isolation af meget rene ab CD4 + CD8 +-T-celler og DN-T-celler fra det murine nyre. Kort fortalt vi fordøje nyrevæv hjælp collagenase og isolere nyre mononukleære celler (KMNC) ved densitetsgradient. Dette efterfølges af to trin for at berige hæmatopoietiske T-celler fra 3% til 70% fra KMNC. Det første trin består af en positiv udvælgelse af hæmatopoietiske celler ved anvendelse af et CD45 + isolation kit. I det andet trin, er DN-T-celler negativt isoleres ved fjernelse af ikke-ønskede celler under anvendelse af CD4, CD8 og MHC klasse II-monoklonale antistoffer og CD1d α-galcer tetramer. Denne strategi fører til en befolkning på mere end 90% rent DN T-celler. Overfladefarvning med ovennævnte antistoffer efterfulgt af FACS-analyse anvendes til at bekræfte renhed.
Introduction
Perifere αβTCR + CD3 + CD4 – CD8 – dobbelt-negative (DN) T-celler er inddelt i forskellige undergrupper, der besidder forskellige fænotyper og funktioner 1-4. DN T-celler er dårligt forstået, men i stigende grad impliceret i patofysiologiske immunreaktioner i forskellige sygdomsmodeller 4-6.
DN T-celler er en unik immun celle type, der i stigende grad impliceret i reguleringen af forskellige immun-og autoimmune reaktioner og modulering af allotransplant tolerance. 4-6, 9 De er sjældne i det perifere blod og sekundære lymfoide organer (milt og lymfeknuder ). Men de er vigtige beboere i den normale nyre og tarm epitel 10-12. Meget lidt er kendt om deres funktion 7 i nyren i steady state og under patologiske tilstande såsom akut nyreskade (AKI), der er forbundet med nyre Transplant.
På grund af de indviklede roller forskellige immunceller i reguleringen immunreaktioner, herunder alloresponses, definere rollen for hver spiller er afgørende i forståelsen alloresponses og designe nye lægemidler. Da det store antal DN-T-celler til stede i nyrerne under fysiologiske og forskellige sygdomstilstande er tilbøjelige til at spille en afgørende rolle i reguleringen af immun-og autoimmune reaktioner i mus og mennesker, og alloresponses transplanterede patienter DN-T-celler. Akkumulerende men stadig spredt beviser implicerer DN T-celler i både sygdomsfremkaldende og immunosuppressive funktioner, men det er dårligt forstået, hvorfor og hvordan de udviser en bestemt skadelig eller undertrykkende funktion og hvordan miljøet påvirker dem.
På grund af deres lav tæthed i nyren, er det nødvendigt forbedrede metoder til isolation.
Der er i øjeblikket ingen standard-protokol til isolering af DN T-celler fra than ikke lymfoide væv. Vores protokol beskriver en hidtil ukendt fremgangsmåde til isolering af DN-T-celler fra nyrer; imidlertid kan fremgangsmåden også anvendes til forskellige ikke-lymfevæv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er voksende interesse i DN-T-celler, eftersom de bliver impliceret i forskellige patologiske tilstande, såsom autoimmune sygdomme, cancer, graft-tolerance og primære sygdomme i nyrerne, herunder akut nyreskade (AKI), glomerulonephritis 8, 13. Derfor er der behov for bedre at forstå og karakterisere de patofysiologiske funktioner i DN T-celler. Men i øjeblikket er der en mangel på forståelse af disse cellers funktion i forhold til CD4 og CD8 T-celler. En væsentlig årsag er mangel på DN T-celler i …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er støttet af NIH PBS (R21 AI095484). Vi takker NHI tetramere core facilitet for CD1d tetramer.
Materials
| Laminar flow hood | Baker Company, Inc | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Atmosphere-controlled incubator | Fisher Scientific | (37°C with 5% CO2) | |
| Microscope | Olympus | Or equivalent equipment | |
| Analytical flow cytometer | LSR II | ||
| Name of the reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Fetal bovine serum | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0.1% sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Buffer phosphate buffered saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10X | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS columns | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ microbeads | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Biotin microbeads | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Pacific Blue (ab-chain, clone: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinylated (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 biotinylated (clone 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated | BD | 553143 | |
| anti-MHC class II (I-A d) biotinylated | BD | 553609 | |
| anti-CD1d PBS-57 tetramer | NHI tetramer | lote # 15621-PBS57 | |
| AutoMACS Running Buffer- MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Kidneys – Lymph Nodes |
| Petri dish | BD Biosciences | 356517 | |
| 70mc filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Plunger | Or equivalent equipment | ||
| GeneMate Tubes 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | Or equivalent equipment |
| GeneMate Tubes 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | Or equivalent equipment |
| Petri Dish | Fisher Scientific | S33580 | |
| Plate 24 wells | BD Biosciences | 354723 |
References
- Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
- Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
- Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
- Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
- Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
- Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
- Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
- Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
- Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
- Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
- Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
- Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
- Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
- Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
- Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
- Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).
