신장에서 더블 네거티브 (Double Negative) αβ의 T 세포의 분리
Summary
DNabT 세포가 말초 T 세포 사이 드물다; 그러나, 그들은 특정 비 림프 조직에 풍부합니다. 비 림프 조직에서 DN T 세포를 분리의 어려움은 병태 생리 학적 중요성을 인식 증가에도 불구하고 자신의 기능 분석을 방해한다. 우리는 쥐의 신장에서 고순도 DN T 세포의 분리를 위해 새로운 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
비 림프 조직에서 DN T 세포의 분리를위한 표준 프로토콜은 다양한 면역 반응에서의 점점보고 참여에도 불구하고 현재 없습니다. DN T 세포는 allotransplants 1-6로 면역 및자가 면역 반응과 내성을 조절에 연루되어 고유 한 면역 세포의 유형입니다. DN T 세포는 말초 혈액 및 이차 림프 기관 (비장과 림프절)에서 드문,하지만,하지만, 정상적인 신장의 주요 거주자입니다. 아주 작은 인해 주변에서의 소수 자신의 병태 생리 학적 기능 7에 대한 알려져있다. 우리는 최근에 정상 상태 및 허혈 재관류 손상시 신장 8이 인구의 포괄적 인 표현형 및 기능 분석을 설명했다. DN T 세포 기능 분석을 크게 신장에서의 그들의 분리를위한 프로토콜을 개발함으로써 강화 될 것이다.
여기, 우리는 isolatio 수있는 새로운 프로토콜을 설명뮤린 신장으로부터 고순도 AB CD4 + CD8 + T 세포 및 DN T 세포의 N. 간단히 말해서, 우리는 콜라게나 제를 사용하여 신장 조직을 소화하고 밀도 구배에 의해 신장 단핵 세포 (KMNC)를 분리. 이것은 KMNC에서 70 %로 3 %에서 조혈 T 세포를 풍부하게하기 위해 두 단계로 이어진다. 첫 번째 단계는 CD45 + 분리 키트를 사용하여 조혈 세포의 포지티브 선택으로 구성된다. 두 번째 단계에서는, DN T 세포는 부정적인 CD4, CD8, 및 MHC 클래스 II 단일 클론 항체 및 CD1D α-galcer 량체를 사용하여 원하지 않는 세포의 제거에 의해 격리됩니다. 이 전략은 90 % 이상 순수 DN T 세포의 인구에 이르게한다. FACS 분석이어서 상기 항체 표면 염색은 순도를 확인하기 위하여 사용된다.
Introduction
주변 αβTCR + CD3 + CD4 – CD8 – 이중 부정은 (DN) T 세포는 별개의 표현형과 기능 1-4을 가지고 다양한 하위 집합으로 분할된다. DN T 세포는 제대로 이해하고 있지만 점점 다른 질병 모델 4-6의 병태 생리 학적 면역 반응에 연루된다.
DN T 세포는 점점 더 다양한 면역 및자가 면역 반응의 조절과 이식 실험 관용의 변조에 연루되는 고유 한 면역 세포의 유형입니다. 4-6, 9 그들은 비장과 림프절 (말초 혈액 및 이차 림프 기관에 드문 ). 그러나, 그들은 정상 신장 및 소화관 상피 10-12의 주요 거주자. 약간은 정상 상태에서의 신장에서의 기능 7에 대해 이러한 신장 transpl과 관련된 급성 신장 손상 (AKI)과 같은 병적 인 조건에서 알려져있다개미.
이 때문에, 각 플레이어의 역할을 정의 alloresponses 포함한 면역 반응을 조절하는 다른 면역 세포의 복잡한 역할은 alloresponses 승낙 새로운 치료제를 설계하는데 중요하다. 생리적 및 다양한 질병 상태에서 신장에 존재 DN T 세포의 상당수 감안 DN T 세포는 이식 수혜자에서 중요한 마우스 및 인간 면역 및자가 면역 반응을 조절하는데 역할 및 alloresponses 재생할 가능성이있다. 아직도 흩어져있는 증거 불구하고 축적하는 것은 모두 병원성 및 면역 기능에 DN T 세포를 연루하지만, 왜, 어떻게 그들이 특정 유해하거나 억제 기능을 발휘하고 환경 영향을 그들이 어떻게 그것을 제대로 이해된다.
때문에 신장에서의 낮은 풍요, 분리의 개선 된 방법이 필요합니다.
t에서 DN T 세포의 분리를위한 표준 프로토콜은 없습니다그는 비 림프 조직. 우리 프로토콜은 신장에서 DN T 세포의 분리를위한 신규 한 방법을 설명한다; 그러나, 상기 방법은 또한 다양한 비 – 림프 조직을 위해 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
그들은 같은자가 면역 질환, 암, 이식 허용, 급성 신장 손상 (AKI)을 포함하여 신장의 주요 질환과 같은 다른 병리학 적 조건에 연루되고 있기 때문에 DN T 세포에 대한 관심이 증가가, 8, 13 사구체 신염. 따라서, 더 나은 DN T 세포의 병태 생리 학적 기능을 이해 및 특성화가 필요하다. 그러나, 현재 CD4와 CD8 T 세포에 비해 이러한 세포의 기능에 대한 이해의 부족이있다. 가장 큰 이유는 차 림프 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH PBS (R21 AI095484)에 의해 지원된다. 우리는 CD1D 량체를위한 NHI의 테트라 핵심 시설을 감사합니다.
Materials
| Laminar flow hood | Baker Company, Inc | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Atmosphere-controlled incubator | Fisher Scientific | (37°C with 5% CO2) | |
| Microscope | Olympus | Or equivalent equipment | |
| Analytical flow cytometer | LSR II | ||
| Name of the reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Fetal bovine serum | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0.1% sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Buffer phosphate buffered saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10X | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS columns | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ microbeads | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Biotin microbeads | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Pacific Blue (ab-chain, clone: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinylated (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 biotinylated (clone 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated | BD | 553143 | |
| anti-MHC class II (I-A d) biotinylated | BD | 553609 | |
| anti-CD1d PBS-57 tetramer | NHI tetramer | lote # 15621-PBS57 | |
| AutoMACS Running Buffer- MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Kidneys – Lymph Nodes |
| Petri dish | BD Biosciences | 356517 | |
| 70mc filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Plunger | Or equivalent equipment | ||
| GeneMate Tubes 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | Or equivalent equipment |
| GeneMate Tubes 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | Or equivalent equipment |
| Petri Dish | Fisher Scientific | S33580 | |
| Plate 24 wells | BD Biosciences | 354723 |
References
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