Se presenta la síntesis de un hidrogel de proteína dividida intein mediada. Los bloques de construcción de este hidrogel son dos copolímeros de proteína conteniendo cada uno una subunidad de una proteína trimérica que sirve como un agente de reticulación y una media de un intein dividida. La mezcla de los dos copolímeros de proteínas desencadena una reacción de trans-empalme inteína, produciendo una unidad de polipéptido que se auto-ensambla en un hidrogel. Este hidrogel es altamente pH y temperatura estable, compatible con disolventes orgánicos, y fácilmente incorpora proteínas globulares funcionales.
Se presenta la síntesis de un hidrogel altamente estable de proteínas mediada por una reacción de trans-empalme proteína dividida inteína catalizada. Los bloques de construcción de este hidrogel son dos copolímeros de bloque de proteína conteniendo cada uno una subunidad de una proteína trimérica que sirve como un agente de reticulación y una media de un intein dividida. Una bobina al azar altamente hidrófilo se inserta en uno de los copolímeros de bloque para la retención de agua. La mezcla de los dos copolímeros de bloques de proteína desencadena una reacción de trans-empalme inteína, produciendo una unidad de polipéptido con agentes de reticulación en cada extremo que rápidamente se auto-ensambla en un hidrogel. Este hidrogel es muy estable bajo condiciones ácidas y básicas, a temperaturas de hasta 50 ° C, y en disolventes orgánicos. El hidrogel rápidamente las reformas después de la ruptura inducida por cizalla. La incorporación de una "estación de acoplamiento peptídico" en el bloque de construcción de hidrogel permite la incorporación conveniente de "proteína de acoplamiento"-etiquetados proteínas diana.El hidrogel es compatible con el medio de crecimiento de cultivo de tejidos, apoya la difusión de moléculas de 20 kDa, y permite la inmovilización de proteínas globulares bioactivos. La aplicación del hidrogel de proteína mediada por inteína-como un biocatalizador compatible con disolventes orgánicos se demostró mediante la encapsulación de la enzima peroxidasa de rábano picante y corroborar su actividad.
Los hidrogeles hechos enteramente de las proteínas tienen el potencial para avanzar significativamente campos tan diversos como la ingeniería de tejidos, la administración de fármacos y biofabricación 1. Ofrecen ventajas sobre hidrogeles poliméricos sintéticos tradicionales, incluyendo la biocompatibilidad y el potencial para apoyar de forma no invasiva la incorporación de proteínas globulares bioactivos.
En este trabajo se describe el desarrollo de una novela de hidrogel de proteína formada por una reacción de trans-empalme proteína dividida intein mediada y su aplicación como un andamio inmovilización de proteínas (Figura 1). Los bloques de construcción para este hidrogel son dos copolímeros de bloque de proteína que comprenden cada uno el fragmento N-o C-terminal de una fracción de intein (EN e IC) y una subunidad de una proteína multimérica reticulante. La inteína DnaE de Nostoc punctiforme (Npu) se utilizó como la división inteína 2,3 y una pequeña proteína trimérica (12 kDa) CUTA de Pyrococcus horikoshii </ Em> se utilizó como 4,5 proteína reticulante. Diferentes agentes de reticulación se unen a través de reacción de trans-empalme inteína catalizada, lo que lleva a la formación de una red de proteínas altamente reticulado (hidrogel). Inteína Npu fue elegido debido a su cinética de reacción rápida (t 1/2 = 63 seg) y alto rendimiento trans-empalme (cerca del 80%) 2,3. La proteína CUTA fue elegido como el agente de reticulación debido a su alta estabilidad. Trímeros CUTA tienen una temperatura de desnaturalización de cerca de 150 ° C y conservan la estructura cuaternaria trimérica en soluciones que contienen tanto como 5 M hidrocloruro de guanidina 4,6. Desde intercambio de subunidades entre diferentes agentes de reticulación es un contribuyente importante de la erosión de la superficie de hidrogel física 7, la fuerte interacción entre la subunidad de Cuta debería desalentar este tipo de intercambios de subunidades, lo que lleva a un hidrogel más estable. Uno de estos bloques de construcción también contiene un péptido S-fragmento altamente hidrofílico como la mitad de la cuadra para facilitar aguaretención 8.
La mezcla de los dos bloques de construcción de hidrogel inicia una reacción de trans-empalme entre el EN y IC inteína fragmentos, la generación de una cadena de polipéptido más largo con agentes de reticulación en ambos terminales. Los reticulantes de múltiples tales unidades moleculares interactúan entre sí, formando una red de hidrogel altamente reticulado (Figura 1A). Una "estación de acoplamiento de péptidos" específica (DSP) se incorpora en uno de los bloques de construcción de hidrogel para facilitar la inmovilización estable de una "proteína de acoplamiento" (DP)-etiquetados proteína diana en el hidrogel. El uso de una fracción de inteína para mediar el ensamblaje de hidrogel no sólo proporciona una flexibilidad adicional para la síntesis de hidrogel de proteína, sino que también permite alta densidad, una carga uniforme de la proteína diana a través de todo el hidrogel, como las proteínas diana se cargan antes de la formación de hidrogel.
La proteína de hidrogel intein mediada es altamente Stables en solución acuosa con poca o ninguna erosión detectable después de 3 meses a temperatura ambiente. Estabilidad es retenido en una amplia gama de pH (6-10) y temperaturas (4-50 ° C), y el hidrogel también es compatible con disolventes orgánicos. Este hidrogel se usa para la inmovilización de dos proteínas globulares: la proteína fluorescente verde (GFP) y la peroxidasa de rábano picante (HRP). Hidrogel atrapando la última proteína se utiliza para realizar la biocatálisis en un disolvente orgánico.
En este trabajo, hemos demostrado la síntesis de una gran estabilidad de hidrogel de proteína intein mediada. El uso de una fracción de inteína permite el hidrogel que se forme condicionalmente en respuesta a la mezcla de dos componentes en fase líquida. En concreto, la división inteína covalente une dos bloques de construcción en fase líquida a través de una reacción de trans-empalme, produciendo una unidad polipéptido flanqueada por unidades de reticulación que a su vez auto se ensambla en un hid…
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer al Dr. David Tirrell (Caltech), por su amable donación del plásmido pQE9 AC 10 ATRP 12, el Dr. Tom Muir (Universidad de Princeton) por su amable donación del plásmido kanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr. Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japón) por su amable donación del plásmido pET30-cuta-Tip1 10, y el Dr. Jay D. Keasling (UC Berkley) por su amable donación del plásmido pJD757 13 . Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias CARRERA, EE.UU. Fuerza Aérea YIP y Programa de Investigación Avanzada Hackman Norman.
Name |
Company |
Catalog Number |
Comments |
Phusion High Fidelity DNA polymerase |
New England BioLabs |
M0530S |
|
Competent Escherichia coli BL21 (DE3) |
New England BioLabs |
C2527I |
|
Luria Bertani |
VWR |
90003-350 |
|
Bacto Agar Media |
VWR |
||
kanamycin sulfate |
VWR |
||
IPTG |
VWR |
EM-5820 |
|
Imidazole |
VWR |
EM-5720 |
|
Urea |
VWR |
EM-9510 |
|
Dithiothreitol (DTT) |
Fisher |
BP172-5 |
|
Protease Inhibitor cocktail |
Roche Applied Science |
11836153001 |
|
DPBS |
VWR |
82020-066 |
|
Brilliant Blue R |
Acros Organics |
A0297990 |
|
Sodium Azide |
Fisher |
AC190380050 |
Caution, highly toxic |
Horseradish peroxidase |
Sigma |
P8125-5KU |
|
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine |
Fisher |
AC408460250 |
Caution, highly toxic |
phenol |
Fisher |
AC149340500 |
Caution, highly toxic |
tert-butyl hydroperoxide |
Fisher |
AC180340050 |
Caution, highly toxic |
n-heptane |
Acros Organics |
120340010 |
|
[header] | |||
Shaker/Incubator |
Fisher Scientific |
Max Q 6000 |
|
Centrifuge |
Sorvall |
RC 6 |
|
Sonicator |
QSonica |
Misonix 200 |
|
Ultrafiltration Tubes |
Amicon Ultra |
UFC903024 |
|
Ni Sepharose High Performance HisTrap column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5248-01 |
|
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5156-01 |
|
Plate reader |
Molecular Devices |
SpectraMax Gemini EM |