التوليف من البروتين الاصطناعي Intein بوساطة هيدروجيل
Summary
نقدم توليف هيدروجيل تقسيم بوساطة intein البروتين. اللبنات الأساسية لهذا هيدروجيل نوعان من بوليمرات البروتين تحتوي كل منها على حدة فرعية من البروتين مثلوثي التي هي بمثابة crosslinker ونصف من intein الانقسام. خلط اثنين من بوليمرات بروتين يطلق رد فعل عبر الربط intein، مما أسفر عن وحدة ببتيد تتحول ذاتيا إلى هيدروجيل. هذا هو غاية هيدروجيل درجة الحموضة ودرجة الحرارة مستقرة، ومتوافقة مع المذيبات العضوية، ويشتمل على البروتينات الكروية بسهولة وظيفية.
Abstract
نقدم تخليق البروتين هيدروجيل درجة عالية من الاستقرار بوساطة تقسيم المحفزة intein البروتين رد فعل عبر الربط. اللبنات الأساسية لهذا هيدروجيل نوعان من البروتين كتلة بوليمرات تحتوي كل منها على حدة فرعية من البروتين مثلوثي التي هي بمثابة crosslinker ونصف من intein الانقسام. يتم إدخال اللولب عشوائي ماء غاية في واحدة من كتلة بوليمرات لاحتباس الماء. خلط اثنين من بوليمرات كتلة البروتين يؤدي رد فعل عبر الربط intein، مما أسفر عن وحدة ببتيد مع crosslinkers إما في نهاية بسرعة أن تتحول ذاتيا إلى هيدروجيل. هذا هيدروجيل مستقرة جدا في ظل الظروف الحمضية والأساسية على حد سواء، في درجات حرارة تصل إلى 50 درجة مئوية، وفي المذيبات العضوية. هيدروجيل بسرعة بعد الإصلاحات التي يسببها تمزق القص. إدماج "الالتحام محطة الببتيد" في لبنة هيدروجيل تمكن من إدماج مريحة "بروتين الالتحام" الموسومة البروتينات المستهدفة.هيدروجيل متوافق مع وسائل الاعلام نمو زراعة الأنسجة، ويدعم نشر 20 كيلو دالتون جزيئات، وتمكن من تجميد البروتينات الكروية النشطة بيولوجيا. وقد تجلى تطبيق هيدروجيل البروتين بوساطة intein-بمثابة حفاز بيولوجي العضوية المذيبات متوافق عن طريق التغليف أنزيم البيروكسيداز الفجل ومؤيدة نشاطها.
Introduction
الهلاميات المائية مصنوع بالكامل من البروتينات تنطوي على إمكانية لتحقيق تقدم كبير حقول متنوعة مثل هندسة الأنسجة، والتسليم المخدرات وbiofabrication 1. أنها توفر مزايا أكثر من الهلاميات المائية الاصطناعية البوليمر التقليدية بما في ذلك توافق مع الحياة والقدرة على دعم noninvasively إدراج البروتينات الكروية النشطة بيولوجيا.
في هذا العمل، ونحن تصف وضع هيدروجيل البروتين الرواية شكلت عن طريق تقسيم بوساطة intein البروتين عبر الربط رد الفعل وتطبيقه كما سقالة البروتين الشلل (الشكل 1). اللبنات الأساسية لهذا هيدروجيل هما البروتين كتلة بوليمرات يتألف كل منها جزء أو N-C-محطة من انقسام intein (IN و IC) وحدة فرعية من البروتين crosslinker multimeric. تم استخدام DnaE intein من نوستوك punctiforme (NPU) كما الانقسام وintein 2،3 بروتين صغير مثلوثي (12 كيلو دالتون) CutA من Pyrococcus horikoshii <م /> وقد استخدم بوصفه 4،5 بروتين crosslinker. وانضم crosslinkers المختلفة من خلال تحفيز intein رد فعل عبر الربط، مما يؤدي إلى تكوين شبكة البروتين crosslinked للغاية (هيدروجيل). وقد تم اختيار NPU intein بسبب حركية في رد فعل سريع (ر 1/2 = 63 ثانية) وعالية الغلة عبر الربط (على مقربة من 80٪) 2،3. وقد تم اختيار البروتين CutA كما crosslinker بسبب الاستقرار العالية. أرتب CutA لديها درجة حرارة تمسخ من قرب 150 درجة مئوية، والاحتفاظ هيكل رباعي مثلوثي في الحلول التي تحتوي على قدر 5 M جوانيداين هيدروكلوريد 4،6. منذ الصرف الوحيدات بين crosslinkers مختلفة هو المساهم الرئيسي في هيدروجيل المادية تآكل السطح 7، ينبغي أن التفاعل بين الوحيدات قوية جدا في CutA تثبيط مثل هذه التبادلات الوحيدات، مما أدى إلى هيدروجيل أكثر استقرارا. واحدة من هذه اللبنات يحتوي أيضا على درجة عالية من الببتيد ماء S-جزء من منتصف لبنة لتسهيل المياهالاحتفاظ 8.
خلط اثنين من اللبنات هيدروجيل يبدأ رد فعل عبر الربط بين IN و IC intein شظايا، وتوليد سلسلة ببتيد أطول مع crosslinkers في كل المحطات. Crosslinkers من هذه الوحدات الجزيئية متعددة تتفاعل مع بعضها البعض، وتشكيل شبكة هيدروجيل crosslinked عالية (الشكل 1A). وأدرج محددة "الالتحام محطة الببتيد" (DSP) في واحدة من اللبنات هيدروجيل لتسهيل الشلل مستقرة من "البروتين لرسو السفن" (DP) الموسومة البروتين المستهدف في هيدروجيل. استخدام انقسام intein للتوسط في التجمع هيدروجيل لا يوفر فقط المزيد من المرونة لتخليق البروتين هيدروجيل، ولكن أيضا تمكن عالية الكثافة والتحميل موحدة من البروتين المستهدفة في جميع أنحاء هيدروجيل بأكمله، كما يتم تحميل البروتينات المستهدفة قبل تشكيل هيدروجيل.
البروتين هيدروجيل بوساطة intein هو ستا عاليةبلي في محلول مائي مع القليل إلى أي تآكل اكتشافها بعد 3 أشهر في درجة حرارة الغرفة. يتم الاحتفاظ الاستقرار في مجموعة واسعة من بالوسط (6-10) ودرجات الحرارة (4-50 درجة مئوية)، وهيدروجيل هو أيضا متوافقة مع المذيبات العضوية. ويستخدم هذا هيدروجيل لتجميد اثنين من البروتينات الكروية: بروتين الفلورية الخضراء (GFP) والبيروكسيداز الفجل (HRP). يستخدم هيدروجيل رهينة البروتين الأخير لأداء التحفيز الأحيائي في المذيبات العضوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا العمل، أثبتنا تركيب مستقر للغاية بوساطة intein البروتين هيدروجيل. استخدام انقسام تمكن intein هيدروجيل التي سيتم تشكيلها مشروط في استجابة لخلط اثنين من مكونات السائل المرحلة. على وجه التحديد، وانقسام يربط intein تساهميا اثنين من اللبنات السائل المرحلة عن طريق تفاعل …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أنوه الدكتور ديفيد Tirrell (كالتك) لله هدية نوع من البلازميد pQE9 AC 10 Atrp 12، والدكتور توم موير (جامعة برينستون) لله هدية نوع من البلازميد KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11، الدكتور تاكيهيسا ماتسودا (معهد كانازاوا للتكنولوجيا، Hakusan، إيشيكاوا، اليابان) لله هدية نوع من البلازميد pET30-CutA-Tip1 10، والدكتور جاي D. كسيلينغ (UC بيركلي) لله هدية نوع من البلازميد pJD757 13 . وأيد هذا العمل في جزء من المؤسسة الوطنية للعلوم المهنية، الولايات المتحدة القوات الجوية بييب ونورمان هاكمان برنامج البحوث المتقدمة.
Materials
|
Name |
Company |
Catalog Number |
Comments |
|
Phusion High Fidelity DNA polymerase |
New England BioLabs |
M0530S |
|
|
Competent Escherichia coli BL21 (DE3) |
New England BioLabs |
C2527I |
|
|
Luria Bertani |
VWR |
90003-350 |
|
|
Bacto Agar Media |
VWR |
||
|
kanamycin sulfate |
VWR |
||
|
IPTG |
VWR |
EM-5820 |
|
|
Imidazole |
VWR |
EM-5720 |
|
|
Urea |
VWR |
EM-9510 |
|
|
Dithiothreitol (DTT) |
Fisher |
BP172-5 |
|
|
Protease Inhibitor cocktail |
Roche Applied Science |
11836153001 |
|
|
DPBS |
VWR |
82020-066 |
|
|
Brilliant Blue R |
Acros Organics |
A0297990 |
|
|
Sodium Azide |
Fisher |
AC190380050 |
Caution, highly toxic |
|
Horseradish peroxidase |
Sigma |
P8125-5KU |
|
|
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine |
Fisher |
AC408460250 |
Caution, highly toxic |
|
phenol |
Fisher |
AC149340500 |
Caution, highly toxic |
|
tert-butyl hydroperoxide |
Fisher |
AC180340050 |
Caution, highly toxic |
|
n-heptane |
Acros Organics |
120340010 |
|
| [header] | |||
|
Shaker/Incubator |
Fisher Scientific |
Max Q 6000 |
|
|
Centrifuge |
Sorvall |
RC 6 |
|
|
Sonicator |
QSonica |
Misonix 200 |
|
|
Ultrafiltration Tubes |
Amicon Ultra |
UFC903024 |
|
|
Ni Sepharose High Performance HisTrap column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5248-01 |
|
|
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5156-01 |
|
|
Plate reader |
Molecular Devices |
SpectraMax Gemini EM |
References
- Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M. Protein Engineering in the Development of Functional Hydrogels. Ann. Rev. Biomed. Eng. 12, 167-186 (2010).
- Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme. FEBS Lett. 580, 1853-1858 (2006).
- Zettler, J., Schutz, V., Mootz, H. D. The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction. FEBS Lett. 583, 909-914 (2009).
- Tanaka, Y., et al. Structural implications for heavy metal-induced reversible assembly and aggregation of a protein: the case of Pyrococcus horikoshii CutA. FEBS Lett. 556, 167-174 (2004).
- Sawano, M., et al. Thermodynamic basis for the stabilities of three CutA1s from Pyrococcus horikoshii,Thermus thermophilus, and Oryza sativa, with unusually high denaturation temperatures. Biochimie. 47, 721-730 (2008).
- Tanaka, T., et al. Hyper-thermostability of CutA1 protein, with a denaturation temperature of nearly 150 degrees C.. FEBS Lett. 580, 4224-4230 (2006).
- Shen, W., Zhang, K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Tuning the erosion rate of artificial protein hydrogels through control of network topology. Nat. Mater. 5, 153-158 (2006).
- McGrath, K. P., Fournier, M. J., Mason, T. L., Tirrell, D. A. Genetically directed syntheses of new polymeric materials. Expression of artificial genes encoding proteins with repeating -(AlaGly)3ProGluGly- elements. J. Am. Chem. Soc. 114, 727-733 (1992).
- Ramirez, M., Guan, D., Ugaz, V., Chen, Z. Intein-triggered artificial protein hydrogels that support the immobilization of bioactive proteins. J. Am. Chem. Soc. 135, 5290-5293 (2013).
- Ito, F., et al. Reversible hydrogel formation driven by protein-peptide-specific interaction and chondrocyte entrapment. Biomaterials. 31, 58-66 (2010).
- Lockless, S. W., Muir, T. W. Traceless protein splicing utilizing evolved split inteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10999-11004 (2009).
- Shen, W., Lammertink, R. G. H., Sakata, J. K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Assembly of an artificial protein hydrogel through leucine zipper aggregation and disulfide bond formation. Macromolecules. 38, 3909-3916 (2005).
- Dueber, J. E., et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux. Nat. Biotechnol. 27, (2009).
- Bruns, N., Tiller, J. C. Amphiphilic network as nanoreactor for enzymes in organic solvents. Nano Lett. 5, 45-48 (2005).
- Das, D., et al. Water gelation of an amino acid-based amphiphile. Chem. Eur. J. 12, 5068-5074 (2006).
- Cao, Y., Li, H. Engineering tandem modular protein based reversible hydrogels. Chem. Commun. , 4144-4146 (2008).
- Wu, X., et al. Structural basis for the specific interaction of lysine-containing proline-rich peptides with the N-terminal SH3 domain of c-Crk. Structure. 3, 215-226 (1995).
- Nguyen, J. T., Turck, C. W., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N., Lim, W. A. Exploiting the basis of proline recognition by SH3 and WW domains: Design of n-substituted inhibitors. Science. 282, 2088-2092 (1998).
- Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins. Macromolecules. 43, 9094-9099 (2010).
